PiggyBac gRNA発現ベクター

概要

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます(同様にZFNやTALENなどもよく利用されます)。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA(gRNA)と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

CRISPRによる遺伝子ターゲティングには細胞内で標的配列特異的なgRNAとCas9が共発現している必要があります。Cas9とgRNAをひとつのベクター(all-in-oneベクター)から発現させるか、Cas9とgRNAをそれぞれ独立したベクターから発現させることによって共発現が可能になります。Cas9とgRNAの発現に独立したベクターを使うメリットは、実験目的に応じて様々なgRNAとCas9(野生株Cas9、ニッケース、不活性型Cas9など)を柔軟に組み合わせて使用できる点です。さらに、あらかじめ高レベルかつ安定してCas9を発現している細胞もしくは生体に対して様々な標的配列をもつgRNA発現ベクターを導入できます。この方法ならば、それぞれのgRNAが同じ細胞もしくは生体に対してどのくらいの遺伝子ターゲティング効率を持っているのかを比較検討できます。

            当社のPiggyBac gRNA発現ベクターは宿主哺乳類細胞ゲノムへgRNAを高効率かつ恒久的に導入できます。PiggyBac CRISPRシステムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドとよばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、2つのITR(inverted terminal repeats)が転移されるDNA配列を挟み込むかたちで配置されています。gRNAはITRのあいだにクローニングされます。gRNAはヒトU6プロモーターから発現して、Cas9を標的DNAサイトへと誘導します。ヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドが標的細胞に同時導入されると、ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはトランスポゾンプラスミド上の2つのITRを認識してITRとそのあいだの領域を宿主ゲノムへ挿入します。piggyBacトランスポゾンはゲノムのTTAA配列に挿入されます。挿入の過程でTTAA配列は複製されて挿入場所の両端に配置されます。

当社のPiggyBac gRNA発現ベクターは実験目的に応じてシングルgRNA発現用とデュアルgRNA発現用のどちらかを選択できます。シングルgRNA発現ベクターはgRNA発現用のヒトU6プロモーターをひとつ、デュアルgRNA発現ベクターはふたつ持ちます。シングルgRNA発現ベクターは遺伝子ノックアウトなどの従来のCRISPRゲノム編集用途に利用され、デュアルgRNA発現ベクターは対となるゲノムサイトを同時に標的とする必要がある用途に利用されます。使用用途として次のようなケースがあります。1)標的サイトに対してペアとなるgRNAとhCas9ニッケース変異体(hCas9-D10A)を使用して、二本鎖DNAのそれぞれの鎖にニック(一本鎖切断)を入れてDSB(double strand break:二本鎖切断)を起こしてゲノム編集を実行する。2)対となるgRNAペアを利用して2ヵ所のDSBを作り出し、そのあいだの配列の欠失を作り出す。3)2つのgRNAによる2つの遺伝子の同時編集。

piggyBacはクラスIIトランスポゾンであり、カット&ペースト様式(転移後に自身のコピーを残さない)で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー&ペースト様式をとります。ヘルパープラスミドは一過的に細胞内に導入され、時間経過とともに失われます。ヘルパープラスミドの宿主細胞からの消失によってゲノムへ挿入されたトランスポゾンは恒久的に固定化されます。もしヘルパープラスミドが再導入されるとトランスポゾンはゲノムの挿入位置から再び転移することがあります。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Science. 339:819 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Cell. 154:1380–9 (2013) Use of Cas9 D10A double nicking for increased specificity
Proc Natl Acad Sci U S A. 114:722 (2017) CRISPR/Cas9 targeting using piggyBac gRNA expressing vectors
Plos One. 12: e0187236 (2017) CRISPR/Cas9 vectors for dual gRNA expression

特徴

当社のPiggyBac gRNA発現ベクターシステムはE.coliでの高コピー数複製、広範な細胞タイプへの高効率な導入および導入遺伝子の高い発現量を実現します。PiggyBac gRNA発現ベクターはヒトU6プロモーターからgRNAを発現して高効率なCRISPRターゲッティングを可能にします。また、実験目的によってシングルgRNAもしくはデュアルgRNAを発現できるベクターを選択できます。

メリット

柔軟性:当社のPiggyBac gRNA発現ベクターは実験目的に応じて多様なCas9バリアント(ヌクレアーゼ、ニッケース、不活性型)と組み合わせて使用できます。さらに、シングルgRNAもしくはデュアルgRNAを発現できるベクターを標的サイトの数に応じて選択できます。

ベクターDNAの恒久的な導入:従来の遺伝子導入法は導入した遺伝子が時間経過とともに宿主から失われます。増殖細胞でこの問題は顕著になります。piggyBacシステムはトランスポゾンによって宿主ゲノムへ遺伝子を挿入するので、ベクターDNAは恒久的にゲノム内に維持されます。

簡便さ:ウイルスを使わないプラスミドベクターによる遺伝子導入法は簡便で高い技術を必要としません。

デメリット

細胞タイプが限定される:PiggyBacベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。非増殖細胞は一般的に増殖細胞よりも効率が悪く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。プラスミドによる遺伝子導入はin vitro用途に限定され、in vivo用途にはほとんど使用されません。これはPiggyBACシステムにも当てはまります。

PAMが必要:CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。

基本コンポーネント

piggyBacシングルgRNA発現ベクター

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポゼースは2つのITR(5' ITR と3' ITR )を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

U6 promoter: ヒトU6 snRNAのプロモーター。small RNAの転写をするRNAポリメラーゼIIIによってgRNAを高レベルで発現する。

gRNA: Streptococcus pyogenes由来のCas9(SpCas9)用のgRNA。

Terminator: gRNAの転写を停止する。

hPGK promoter: ヒトphosphoglycerate kinase 1 遺伝子プロモーター。下流のマーカー遺伝子を遍在的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子(ネオマイシン耐性など)、視覚化用遺伝子(EGFPなど)、デュアルレポーター遺伝子(EGFP/Neoなど)。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

SV40 late pA: SV40(Simian virus 40)のlateポリアデニレーションシグナル。上流Cas9の転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

piggyBacデュアルgRNA発現ベクター

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポゼースは2つのITR(5' ITR と3' ITR )を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

U6 promoter: ヒトU6 snRNAのプロモーター。small RNAの転写をするRNAポリメラーゼIIIによってgRNAを高レベルで発現する。

gRNA #1: 使用されるCas9バリアントに応じたgRNA#1。

gRNA #2: 使用されるCas9バリアントに応じたgRNA#2。

Terminator: gRNAの転写を停止する。

hPGK promoter: ヒトphosphoglycerate kinase 1 遺伝子プロモーター。下流のマーカー遺伝子を遍在的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子(ネオマイシン耐性など)、視覚化用遺伝子(EGFPなど)、デュアルレポーター遺伝子(EGFP/Neoなど)。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

SV40 late pA: SV40(Simian virus 40)のlateポリアデニレーションシグナル。上流Cas9の転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。