PiggyBac Tet調節タンパク質発現ベクター

概要

ベクタービルダー社のpiggyBac Tet調節タンパク質発現ベクターはプラスミドベクターを利用して哺乳類動物細胞にTet調節タンパク質(tTS、rtTA)を恒久的に導入し、テトラサイクリンによるテトラサイクリン応答性(TRE)プロモーター下流の目的遺伝子の発現誘導を可能にします

Tet-On誘導性遺伝子発現システムは哺乳類細胞における目的遺伝子の発現タイミングを制御できる強力なツールです。当社のTet誘導性遺伝子発現ベクターはテトラサイクリン(もしくはドキシサイクリンなどのアナログ)非存在条件下でのほぼ完全な遺伝子発現抑制と、テトラサイクリンの添加に応じた目的遺伝子の強力かつ素早い発現誘導を実現します。当システムはテトラサイクリン非存在下のtTSタンパク質による能動的な発現抑制効果とテトラサイクリン存在下のrtTAタンパク質による強力な発現誘導効果が組み合わされています。TetR(Tet抑制タンパク質)とKRAB-AB(Kid1タンパク質の転写抑制ドメイン)の融合タンパク質であるtTSはテトラサイクリン非存在条件でTRE(tetracycline-responsive element)プロモーターに結合して遺伝子の転写を抑制します。一方で、Tet抑制タンパク質の変異体とVP16(単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質の転写活性化ドメイン)との融合タンパク質であるrtTAはテトラサイクリン存在条件でTREプロモーターに結合して遺伝子の転写を活性化します。

当社のPiggyBac Tet調節タンパク質発現ベクターは任意のプロモーターを使用したTet調節タンパク質発現カセットが組み込まれています。しかし、テトラサイクリン非存在条件での発現漏れを最小限に抑え、テトラサイクリン存在条件の発現誘導をするためには、独立したベクターからTREプロモーターから発現される目的遺伝子が提供される必要があります。

PiggyBac Tet調節タンパク質発現システムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されています。ひとつめはヘルパープラスミドと呼ばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、2つのITR(inverted terminal repeats)のあいだに転移させたいDNA配列が組み込まれます。Tet調節タンパク質発現カセットはITRのあいだにクローニングされます。ヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドが標的細胞に同時導入されると、ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはトランスポゾンプラスミド上の2つのITRを認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入します。piggyBacトランスポゾンはゲノムのTTAA配列に挿入されます。挿入の過程でTTAA配列は複製されて挿入場所の両端に配置されます。目的遺伝子の発現はテトラサイクリンとrtTA調節タンパク質の存在条件下で活性化されます。

PiggyBacはクラスIIトランスポゾンであり、カット&ペースト様式(転移後に自身のコピーを残さない)で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー&ペースト様式をとります。ヘルパープラスミドは一過的に細胞内に導入され、時間経過とともに失われます。ヘルパープラスミドの宿主細胞からの消失によってゲノムへ挿入されたトランスポゾンは恒久的に固定化されます。ヘルパープラスミドが再導入された場合、トランスポゾンはゲノムの挿入位置から再び転移することがあります。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報については下記の論文を参照してください

References Topic
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011) Review on the PiggyBac system
Cell. 122:473 (2005) Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice
Science. 268:1766-9 (1995) Development of rtTA
J Gene Med. 1:4-12 (1999) Development of tTS

特徴

当社のPiggyBac Tet調節タンパク質発現ベクターはトランスポゾンを利用した哺乳類動物細胞へのTet調節タンパク質の高効率な導入を可能にし、Tet調節タンパク質tTSとrtTAを共発現することによって、テトラサイクリン非存在条件下の目的遺伝子のほぼ完全な発現抑制とテトラサイクリン添加に応じた強力かつ素早い発現誘導を実現します。PiggyBac Tet調節タンパク質発現ベクターとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範な標的細胞へ高効率なベクター導入および高レベルの遺伝子発現を可能にします。

メリット

恒久的なベクターDNAの挿入: 従来の方法で宿主細胞へ導入されたベクターDNAはほとんどが時間経過とともに失われます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。piggyBacトランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドを使用した遺伝子導入法ならば、トランスポゾンを利用したベクターDNAの宿主ゲノムへの挿入によって恒久的な目的遺伝子の導入が可能です。

簡便さ:PiggyBac Tet誘導性遺伝子発現ベクターは従来の方法によって細胞に導入されます。パッケージング操作が必要なウイルスと比べると非常に簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。当ベクターのバックボーン部分(トランスポゾン関連)は3.0kbほどを占め、残りを任意の目的で使用することができます。

デメリット

細胞タイプが限定される:PiggyBacベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。一般的に非増殖細胞は増殖細胞よりも導入効率が悪くなり、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。くわえて、プラスミドによる遺伝子導入はin vitro用途に限定され、in vivo用途に使用されることは稀です。これらの制限はpiggyBacシステムにも当てはまります。

基本コンポーネント

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポゼースは2つのITR(5' ITR と3' ITR )を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Promoter: Tet調節タンパク質を発現させる任意のプロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: Tet調節タンパク質の遺伝子。

rBG pA: ラビットβ-グロブリンポリアデニレーションシグナル。Tet調節タンパク質遺伝子の転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子(ネオマイシン耐性など)や視覚化用遺伝子(EGFPなど)、もしくはデュアルレポーター遺伝子(EGFP/Neoなど)。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。マーカー遺伝子の転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。