PiggyBac Cas9発現ベクター

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます（同様にZFNやTALENなどもよく利用されます）。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA（gRNA）と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

CRISPRによる遺伝子ターゲティングには細胞内で標的配列特異的なgRNAとCas9が共発現している必要があります。Cas9とgRNAをひとつのベクター(all-in-oneベクター)から発現させるか、Cas9とgRNAをそれぞれ独立したベクターから発現させることによって共発現が可能になります。Cas9とgRNAの発現に独立したベクターを使うメリットは、実験目的に応じて様々なgRNAとCas9（野生株Cas9、ニッケース、不活性型Cas9など）を柔軟に組み合わせて使用できる点です。加えて、Cas9発現ベクターを使ってCas9を安定して高レベル発現する細胞株を確立した後に任意のgRNAを導入することもできます。All-in-one CRISPRベクターを利用した場合よりも均質で高レベルのCas9発現が保障されているためにより効果的な遺伝子ターゲッティングが可能になります。

PiggyBac Cas9発現ベクターシステムはPiggyBacトランスポゾンを基にして開発されています。広範な哺乳類動物細胞を対象として、ベクターのCas9発現カセットを恒久的に宿主ゲノムへ挿入できる簡便かつ高効率なシステムです。PiggyBac Cas9発現ベクターシステムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドとよばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、２つのITR（inverted terminal repeats）のあいだにCas9発現カセットを持ちます。

ヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドが標的細胞に同時導入されると、ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはトランスポゾンプラスミド上の2つのITRを認識してITRとCas9発現カセットを宿主ゲノムへ挿入します。piggyBacはクラスIIトランスポゾンであり、カット＆ペースト様式（転移後に自身のコピーを残さない）で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー＆ペースト様式をとります。ヘルパープラスミドは一過的に細胞内に導入され、時間経過とともに失われます。ヘルパープラスミドの宿主細胞からの消失によってゲノムへ挿入されたトランスポゾンは恒久的に固定化されます。もしヘルパープラスミドが再導入されるとトランスポゾンはゲノムの挿入位置から再び転移することがあります。

当社ではSpCas9（Streptococcus pyogenes由来のCas9）のバリアントを多数用意していますので、実験目的に適したCas9を選択できます。Cas9バリアントとして、１）ヒトコドン使用頻度に最適化され、効率的なDSB（double-strand breaks）生成が可能なhCas9、２）DNAの一本鎖切断（ニック）のみを生成するhCas9ニッケース変異体hCas9-D10A、３）D10AとH840A変異を持つ不活性型hCas9であるdCas9、４）オフターゲット活性を減少させ、特異性を高めたSpCas9-HF1とeSpCas9を用意しています。加えて、dCas9と転写活性化ドメインの融合タンパク質であるdCas9/VP64、dCas9/VPR（CRISPRa用途）や転写抑制ドメインの融合タンパク質dCas9/KRAB（CRISPRi用途）も利用できます。その他にも、遺伝子サイズの小さいCas9バリアントが必要ならばStaphylococcus aureus由来のSaCas9や、DSB後に突出末端を生成するAcidaminococcus 由来のAsCpf1が用意されています。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

当社のPiggyBac トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範な細胞タイプへの高効率な導入を実現します。PiggyBac Cas9発現ベクターは高レベルのCas9発現と配列特異的なgRNAを使用した高効率なCRISPRターゲッティングが可能です。当社では幅広い実験目的に対応したCas9バリアントを用意しています。

ベクターDNAの恒久的な導入：従来の遺伝子導入法は導入した遺伝子が時間経過とともに宿主から失われます。この問題は分裂速度の速い細胞で顕著になります。piggyBacシステムはトランスポゾンによって宿主ゲノムへ遺伝子を挿入するので、ベクターDNAは恒久的にゲノム内に維持されます。

簡便さ：ウイルスを使わないプラスミドベクターによる遺伝子導入法は簡便で高い技術を必要としません。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。プラスミドのバックボーンとトランスポゾン関連配列は3kbほどなので残りのすべてをCas9と選択マーカー等に利用できます。

細胞タイプが限定される：PiggyBacベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。非増殖細胞は一般的に増殖細胞よりも効率が悪く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。プラスミドによる遺伝子導入はin vitro用途に限定され、in vivo用途にはほとんど使用されません。これはPiggyBACシステムにも当てはまります。

PAMが必要：CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。必要なPAM配列は使用するCas9バリアントに依存します。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポゼースは2つのITR（5' ITR と3' ITR ）を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Promoter: Cas9発現用プロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: Cas9バリアントの遺伝子。

rBG pA: ラビットβ-グロブリンポリアデニレーションシグナル。Cas9遺伝子の転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）、視覚化用遺伝子（EGFPなど）、デュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。