PiggyBacベクター (In Vivoエンハンサーテスト用)

概要

当ベクターシステムはマウスモデルで哺乳動物のエンハンサーを研究するために開発されました。エンハンサーと推測される配列をベクター内のマウスhsp68最小プロモーターの上流にクローニングしたのち、トランスジェニックマウスの作製に使用します。トランスジェニックマウス胚や生体におけるLacZレポーターの発現をエンハンサー活性の出力として検出します。当ベクターシステムはエンハンサーの特定、エンハンサーの組織特異性の決定、エンハンサー亜種間の比較や系統追跡など多様な実験に有用です。

当社のpiggyBacトランスポゾンベクターシステムは高効率で外来性DNAを宿主哺乳類細胞のゲノムに挿入できます。当システムはウイルスを利用せず、プラスミドベクターを利用して目的の遺伝子を宿主ゲノムへ恒久的に挿入する簡便なシステムです。

piggyBacシステムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドとよばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、2つのITR(inverted terminal repeats)が転移されるDNA配列を挟み込むかたちで配置されています。エンハンサー配列はトランスポゾンプラスミドのITRのあいだにクローニングされます。ヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドが標的細胞に同時に導入されると、ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはトランスポゾンプラスミド上の2つのITRを認識してITRとそのあいだの領域を宿主ゲノムへ挿入します。piggyBacトランスポゾンはゲノムのTTAA配列に挿入されます。挿入の過程でTTAA配列は複製されて挿入場所の両端に配置されます。

piggyBacはクラスIIトランスポゾンであり、カット&ペースト様式(転移後に自身のコピーを残さない)で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー&ペースト様式をとります。ヘルパープラスミドは一過的に細胞内に導入されるだけなので、時間経過とともに失われます。ヘルパープラスミドの宿主細胞からの消失によってゲノムへ挿入されたトランスポゾンは恒久的に固定化されます。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Nature. 444:499 (2006) Genome-wide testing of putative enhancers in the mouse using a related system
Development. 105:707 (1989) Cloning of the Hsp68 minimal promoter
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011) Review of the piggyBac systems

特徴

当ベクターシステムはpiggyBacトランスポゾンを基に開発されています。エンハンサーと推測される配列はlacZレポーター遺伝子の発現を制御するHsp68最小プロモーターの上流にクローニングされ、検定されます。活性をもつエンハンサー配列は転写因子を誘引して転写機構を活性化させることで最小プロモーターがLacZレポーターを発現できるようになります。エンハンサー活性をもたない場合、Hsp68最小プロモーター自体はほとんど活性をもたないのでLacZはほとんど発現しません。LacZとX-galによるwhole mount胚や組織切片のin situ色素染色はエンハンサー活性の非常に高感度な検出を可能にします。

メリット

簡便で高感度な検出:LacZをレポーターとしたX-gal染色方法は低発現量でも十分に検出可能な青色色素を作り出すのでエンハンサー活性の高感度な検出が可能です。

トランスジェニック動物の作製が容易:従来の前核注入によって効率良くトランスジェニックマウス胚や生体を作成できます。

簡便さ: ウイルス作製などが必要なウイルスベクターよりもプラスミドベクターによる遺伝子導入ははるかに簡便です。

恒久的なベクターDNAの挿入: 従来の形質転換法では宿主細胞へのDNAの導入は時間経過によるDNAの減少のために一過的なものでした。この問題は増殖の速い細胞では特に顕著になります。一方で、piggyBacトランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドを利用することによって恒久的に任意のDNA配列をトランスポゾンと共に宿主ゲノムへ挿入することができるため、長期間にわたる観察が必要な実験が可能になります。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。これによってサイズの大きなエンハンサー配列の検定が可能です。

デメリット

ヘルパープラスミドが必要: 標準的なエンハンサーテスト用プラスミドベクターとは違い、piggyBacシステムはヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドの同時使用が必要です。エンハンサー配列の宿主ゲノムへの挿入のためには両プラスミドが同時に細胞内に存在しなくてはいけません。

基本コンポーネント

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポゼースは2つのITRを認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Enhancer: エンハンサー配列はここに配置される。

Hsp68 minimal promoter: マウスHsp68 (heat shock protein 68kDa)プロモーター由来の最小プロモーター。最小プロモーターは下流のレポーター遺伝子の発現にエンハンサーを必要とする。エンハンサーがないとレポーター遺伝子をほとんど発現しない。

LacZ: β‐ガラクトシダーゼ遺伝子。LacZは無色で可溶性のX-galを青色で不溶性の化合物に変換することでLacZを発現している細胞を染色する。

SV40 late pA: SV40(Simian virus 40)のlateポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写停止を助ける。

3' ITR:  3' inverted terminal repeat。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。