レンチウイルスnon-coding RNA発現ベクター

概要

レンチウイルスnon-coding RNA発現ベクターは哺乳類動物細胞への恒久的なnon-coding RNA導入を可能にします。Non-coding RNAは多種のshort(30塩基以下)もしくはlong(200塩基以上)機能性RNA分子を含みます。micro RNAs (miRNAs)、small interfering RNAs (siRNAs)、piwi-interacting RNAs (piRNAs)、small nuclear RNAs (snRNAs)、small nucleolar RNAs (snoRNAs)、large intergenic non-coding RNAs (lincRNAs)、intronic long non-coding RNAs (intronic lncRNAs)、natural antisense transcripts (NATs)、enhancer RNAs (eRNAs) 、 promoter-associated RNAs (PARs)などの機能性RNAがあります。これらはタンパク質に翻訳されることはありませんが、DNA複製、エピジェネティック制御、転写および転写後制御そして翻訳制御など数多くの細胞内機構で重要な役割を担っています。

レンチウイルスnon-coding RNA発現ベクターはRNAポリメラーゼⅡプロモーターを使用してnon-coding RNAを発現するように設計されているので、組織特異的、誘導性もしくは様々な活性強度を持つプロモーターを使用した多様な実験用途に対応できます。RNAポリメラーゼⅡプロモーターによる転写反応はプロモーターの3‘域から始まり、ポリAシグナル配列内で終了します。そのため、当ベクターから生産されるnon-coding RNAとオリジナルのnon-coding RNAの配列は正確に一致せず、上流と下流にいくつかの配列が追加されます。レンチウイルスベクターにおいて、発現カセットの下流にポリアデニレーションシグナルがあることはウイルスのパッケージングを阻害するので推奨されていません。そのため、non-coding RNAの下流には3‘LTRまでの配列が付与されることになり、non-coding RNAの機能に影響を及ぼす可能性があります。

レンチウイルスnon-coding RNA発現ベクターはE.coli用プラスミドとして作製されます。プロモーター含むnon-coding RNA発現カセットは2つのLTR(long terminal repeat)のあいだにクローニングされます。レンチウイルスnon-coding RNA発現ベクターはヘルパープラスミドとともにパッケージング細胞に導入され、LTRのあいだのDNA配列がウイルスRNAとして転写されます。つづいてヘルパープラスミドから発現するウイルスタンパク質群がウイルスRNAをウイルスにパッケージングします。こうして作られたウイルスは上清に放出され、直接もしくは濃縮した後に標的細胞への感染に用いられます。

ウイルスが標的細胞に感染するとRNAゲノムが細胞内に注入、DNAに逆転写された後に宿主ゲノムへ挿入されます。こうしてLTRのあいだにあるnon-coding RNA発現カセットとウイルスゲノムは宿主ゲノムへ挿入され、恒久的に維持されます。

当社のレンチウイルスnon-coding RNA発現ベクターはウイルスのパッケージングや感染に必要になる遺伝子群が取り除かれています。これらの遺伝子はヘルパープラスミドから提供されます。レンチウイルスベクターによって生産されるウイルスは複製不能(細胞に感染はできるが複製はできない)なので安全です。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Cell. 157:77 (2014) Review on non-coding RNAs
Front Genet. 6:2 (2015) Review on functionality of non-coding RNAs
Int J Oncol. 48:1509 (2016) Lentivirus-mediated expression of long non-coding RNA
J Virol. 72:8463 (1998) The 3rd generation lentivirus vectors
J Virol. 72:9873 (1998) Self-inactivating lentivirus vectors
Nat Protoc. 1:241 (2006) Production and purification of lentiviral vectors

特徴

当社のレンチウイルスnon-coding RNA発現ベクターは第三世代レンチウイルスベクターを基に設計されています。E.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範囲な細胞タイプへの高効率なウイルスの感染、宿主ゲノムへの遺伝子挿入および高レベルのnon-coding RNA発現を実現します。

メリット

ベクターの恒久的な挿入: 従来の方法で宿主細胞へ導入されたnon-coding RNAは時間経過とともに失われてしまいます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。一方でレンチウイルスベクターを用いればnon-coding RNAを恒久的に宿主ゲノムへ挿入できます。

高ウイルスタイター:当社のベクターは非常に高いタイターのウイルスを作製できます(当社のウイルス作製サービスを利用すれば>109 TU/mlが可能)。このレベルのタイターならば適量のウイルス上清を使うことで100%近い遺伝子導入効率が得られます。

非常に幅広い親和性:当社のウイルスパッケージングシステムはVSV-Gエンベロープタンパク質をウイルス表面に追加してあるので幅広い親和性を実現しています。その結果、すべての一般的な哺乳類細胞といくつかの非哺乳類細胞への遺伝子導入が可能です。さらに、ほとんどの哺乳類細胞タイプ(増殖・非増殖細胞、プライマリ細胞、接着・非接着細胞)に遺伝子を導入することも可能です。レンチウイルスベクターはアデノウイルスベクター(いくつかの細胞タイプへの形質転換効率が低い)やMMLVレトロウイルスベクター(非増殖細胞の形質転換が困難)よりも広範な親和性を持つので、従来の遺伝子導入法では難しかった神経細胞もレンチウイルスベクターならば確実に遺伝子導入できます。

プロモーターをカスタマイズ可能:当社ベクターの5'LTRのプロモーターはゲノム挿入時において自己不活性化されるように設計されています。そのため、実験目的に応じて任意のプロモーターを選択してnon-coding RNAを発現できます。これは5'LTRの遍在的なプロモーター活性だけが利用可能となるMMLVレトロウイルスベクターに対して明らかな利点となります。

導入コピー数にばらつきが少ない:従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法は導入ベクターコピー数が細胞ごとに大きなばらつきが生じますが、一般的にウイルスによる遺伝子導入は導入ベクターコピー数が比較的に均一になります。

In vitroとin vivoで有効:レンチウイルスベクターは培養細胞と生体の両方に対して効果的です。

安全性:当ベクターの安全性はふたつの点から保証されます。ひとつめはウイルスのパッケージングと感染に必要な遺伝子群がヘルパープラスミドに移されていること、ふたつめは5' LTR-DU3はプロモーター活性をもたないので感染時にウイルスRNAが転写されません。そのために、複製可能なウイルスが発生する可能性はなく、当社のベクターを使用することによる健康へのリスクは最小限になります。

デメリット

組み込み可能なDNAサイズが限定的:野生株のレンチウイルスゲノムはおよそ9.2kbです。当社のベクター上でウイルスのパッケージング、感染に必要なコンポーネントに2.8kbが割り当てられ、およそ6.4kbを実験目的に利用できます。このサイズ上限を超えた場合、ウイルスタイターは劇的に減少します。通常、当社のベクターはnon-coding RNAのほかにプロモーター、薬剤耐性マーカー等が組み込まれます。もしnon-coding RNAのサイズが大きく、総サイズが6.4kbを超えるならばウイルス生産に支障をきたします。

技術的な複雑さ:レンチウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

基本コンポーネント

RSV promoter: ラウス肉腫ウイルスプロモーター。ウイルスRNAを転写する。その後ウイルスRNAはウイルスにパッケージングされる。

5’LTR-ΔU3: HIV-1の5‘LTR(long terminal repeat)に欠損を起こしたもの。レンチウイルス野生株の5‘LTRと3' LTRは相同配列をもつ。5‘LTRと3‘LTRはウイルスゲノムの両端に同じ向きで配置される。ウイルスゲノムの挿入過程に3‘LTRの配列は5‘LTRに上書きされる。LTRはプロモーターとポリアデニレーションシグナルの両方の機能があり、野生株では5‘LTRはウイルスゲノムを転写するプロモーターとして、3‘LTRは転写終了させるためのポリアデニレーションシグナルとして機能する。当社のベクターでは、5' LTR-ΔU3はウイルスの転写因子TatがLTRのプロモーターを活性化するために必要な配列が欠損している。しかしながら、5' LTR-ΔU3 上流のRSVプロモーターが代わりにプロモーターとして機能するため、この欠損はパッケージング時のウイルスRNAの生産に影響しない。

Ψ: ウイルスRNAのパッケージングに必要なHIV-1パッケージングシグナル。

RRE: HIV-1 Rev response element。ウイルスRNAのパッケージング時のRevタンパク質によるウイルスRNAの核外輸送に必要。

cPPT: HIV-1 Central polypurine tract。細胞感染中にウイルスゲノムの核内輸送を促進させるためのDNAフラップを形成する。ベクターの宿主ゲノムへの挿入効率を上昇させ、形質転換効率を高める。

Promoter:  任意のnon-coding RNA発現用プロモーター。

Non-coding RNA: 実験に使用するnon-coding RNA。

WPRE: ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子。パッケージング細胞のウイルスRNA安定性を増加させ、高ウイルスタイターを実現する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子(ネオマイシン耐性など)や視覚化用遺伝子(EGFPなど)、もしくはデュアルレポーター遺伝子(EGFP/Neoなど)。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

3’LTR-ΔU3: HIV-1の3‘LTRのU3領域に欠損を起こしたもの。ウイルスベクター挿入過程で3' LTRが5' LTRを上書きするために、プロモーター不活性型の5' LTR-ΔU3が宿主ゲノムへ挿入される。3’LTR-ΔU3 のポリアデニレーションシグナルはウイルスパッケージング中と宿主ゲノムに挿入後のすべての転写反応を停止させる。

SV40 early pA: SV40(Simian virus 40)のearlyポリアデニレーションシグナル。ウイルスパッケージング時の3' LTRによるウイルスRNA転写停止を補助する。パッケージング細胞でのウイルスRNAを増加させ高ウイルスタイターを実現する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。