レンチウイルスTet-On誘導性遺伝子発現ベクター

ベクタービルダー社のレンチウイルス誘導性遺伝子発現ベクターは高効率な第3世代レンチウイルスベクターとTet-On誘導性遺伝子発現システムを組み合わせて、宿主細胞ゲノムにテトラサイクリン誘導性遺伝子発現カセットを恒久的に挿入します。

Tet-On誘導性遺伝子発現システムは哺乳類細胞で目的遺伝子の発現タイミングを制御できる強力なツールです。当社のTet-On誘導性遺伝子発現ベクターはテトラサイクリン（もしくはドキシサイクリンなどのアナログ）非存在条件下でのほぼ完全な遺伝子発現抑制と、テトラサイクリンの添加に応じた目的遺伝子の強力かつ素早い発現誘導を実現します。当システムはテトラサイクリン非存在下のtTsタンパク質による能動的な発現抑制効果とテトラサイクリン存在下のrtTAタンパク質による強力な発現誘導効果が組み合わされています。TetR（Tet抑制タンパク質）とKRAB-AB（Kid1タンパク質の転写抑制ドメイン）の融合タンパク質であるtTSはテトラサイクリン非存在条件でTRE（tetracycline-responsive element）プロモーターに結合して遺伝子の転写を抑制します。一方で、Tet抑制タンパク質の変異体とVP16（単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質の転写活性化ドメイン）との融合タンパク質であるrtTAはテトラサイクリン存在条件でTREプロモーターに結合して遺伝子の転写を活性化します。

レンチウイルスベクターシステムは哺乳類細胞への恒久的な遺伝子挿入を可能にします。レンチウイルスベクターはE.coli用プラスミドとして作製され、目的遺伝子を発現するTREプロモーターを含むテトラサイクリン誘導性発現カセットはLTR (long terminal repeat)のあいだにクローニングされます。レンチウイルス誘導性遺伝子発現ベクターとヘルパープラスミドがパッケージング細胞に同時導入されるとLTRのあいだのDNA領域はRNAに転写され、ヘルパープラスミドから発現したウイルスタンパク質によってウイルスにパッケージングされます。こうして作られたウイルスは上清に放出され、直接もしくは濃縮した後に標的細胞への感染に用いられます。

ウイルスが標的細胞に感染するとRNAゲノムは細胞内に注入、そしてDNAに逆転写された後に宿主ゲノムへ挿入されます。こうしてLTRのあいだにある誘導性遺伝子発現カセットは宿主ゲノムへ挿入され、恒久的に維持されます。

当社のレンチウイルス誘導性遺伝子発現ベクターは目的遺伝子を発現するためのTREプロモーターを含む誘導性遺伝子発現カセットが組み込まれていますが、テトラサイクリン非存在条件での発現漏れを最小限に抑え、テトラサイクリン存在条件で発現誘導をするためにはTREに結合する調節タンパク質tTSとrtTAが独立したヘルパープラスミドから供給される必要があります。レンチウイルス誘導性遺伝子発現ベクターシステムの2ベクターシステムはAll-in-oneベクターシステムと比較して、テトラサイクリン誘導条件下においてより高い発現誘導レベルを実現できます。All-in-oneベクターはTREプロモーターによる目的遺伝子発現カセットと遍在的もしくは組織特異的プロモーターによるtTS/rtTA遺伝子発現カセットのふたつを持ちます。レンチウイルスベクターにおいて、LTRのあいだにポリアデニレーションシグナルを配置することはパッケージングを阻害するために推奨されていません。その代わりに3'LTRがもつポリアデニレーションシグナル活性を利用しています。その結果、TREプロモーターからの転写反応はしばしば目的遺伝子を通り過ぎて下流の発現カセットまで継続されます。このことによってtTS/rtTA遺伝子の発現が部分的に阻害されることがあり、目的遺伝子のテトラサイクリン誘導効率を減少させます。そのため当社では誘導効率を最大化するために標的細胞に対して2種類のレンチウイルス（TREプロモーターによって目的遺伝子を発現するレンチウイルスとtTS/rtTA遺伝子を発現するレンチウイルス）を同時感染させることをお勧めしています。

当社のレンチウイルスベクターはウイルスのパッケージングや感染に必要になる遺伝子群が取り除かれています。これらの遺伝子はヘルパープラスミドから提供されます。レンチウイルスベクターによって生産されるウイルスは複製不能（細胞に感染はできるが複製はできない）なので安全です。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

当社のTet-On誘導性遺伝子発現システムはテトラサイクリン非存在条件下の目的遺伝子のほぼ完全な発現抑制と、テトラサイクリン添加に応じた強力かつ素早い発現誘導を可能にします。レンチウイルス誘導性遺伝子発現ベクターは第3世代レンチウイルスベクターシステムを基に開発されています。E.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範囲な細胞タイプへの高効率なウイルスの感染、宿主ゲノムへの遺伝子挿入および高レベル発現を実現します。

厳密な遺伝子発現の活性化： rtTAのみを利用した従来のTet-Onシステムは非誘導条件でも無視できないレベルの発現漏れが存在します。非誘導条件下の発現漏れを最小限にし、幅広いテトラサイクリン濃度に高感度で応答できる当社のTet-On遺伝子発現システムはテトラサイクリンによって遺伝子発現を厳密にon/offできます。

高レベル発現：TREプロモーターは誘導条件下で目的遺伝子を高レベルで発現します。

ベクターの恒久的な挿入： 従来の方法で宿主細胞へ導入されたベクターDNAは時間経過とともに失われてしまいます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。一方でレンチウイルスベクターは宿主細胞へのベクター挿入による遺伝子の恒久的な導入が可能です。

高ウイルスタイター：当社のベクターは非常に高いタイターのウイルスを作製できます（当社のウイルス作製サービスを利用すれば>10⁹ TU/mlが可能）。このレベルのタイターならば適量のウイルス上清を使うことで100％近い遺伝子導入効率が得られます。

非常に幅広い親和性：当社のウイルスパッケージングシステムはVSV-Gエンベロープタンパク質をウイルス表面に追加してあるので幅広い親和性を実現しています。その結果、すべての一般的な哺乳類細胞といくつかの非哺乳類細胞への遺伝子導入が可能です。さらに、ほとんどの哺乳類細胞タイプ（増殖・非増殖細胞、プライマリ細胞、確立された細胞株、幹細胞、分化細胞、接着・非接着細胞など）に遺伝子を導入することも可能です。従来の遺伝子導入法では難しかった神経細胞も当社のレンチウイルスベクターならば確実に遺伝子導入できます。当社のシステムを用いて作製されたレンチウイルスベクターはアデノウイルスベクター（いくつかの細胞タイプへの形質転換効率が低い）やMMLVレトロウイルスベクター（非増殖細胞の形質転換が困難）よりも広範な親和性を持ちます。

導入コピー数にばらつきが少ない：一般的にウイルスによる遺伝子導入は導入ベクターコピー数が比較的に均一になります。従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法は導入ベクターコピー数が細胞ごとに大きなばらつきが生じます。

In vitroとin vivoで有効：レンチウイルスベクターは培養細胞と生体の両方に対して効果的です。

安全性：当ベクターの安全性はふたつの点から保証されます。ひとつめはウイルスのパッケージングと感染に必要な遺伝子群がヘルパープラスミドに移されていること、ふたつめは5' LTR-DU3はプロモーター活性をもたないので感染時にウイルスRNAが転写されません。そのために、複製可能なウイルスが発生する可能性はなく、当社のベクターを使用することによる健康へのリスクは最小限になります。

組み込み可能なDNAサイズが限定的：野生株のレンチウイルスゲノムはおよそ9.2kbです。当社のベクター上でウイルスのパッケージング、感染に必要なコンポーネントに2.8kbが割り当てられ、およそ6.4kbを実験目的に利用できます。このサイズ上限を超えた場合、ウイルスタイターは劇的に減少します。通常、当社のレンチウイルス誘導性遺伝子発現ベクターには目的遺伝子の他にもTREプロモーター、薬剤耐性マーカー等が組み込まれます。もし長大な遺伝子を組み込むなどの理由で総サイズが6.4kbを超えるならばウイルス生産に支障をきたすこともあります。

技術的な複雑さ：レンチウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

RSV promoter: ラウス肉腫ウイルスプロモーター。ウイルスRNAを転写する。その後ウイルスRNAはウイルスにパッケージングされる。

5’LTR-ΔU3: HIV-1の5‘LTR（long terminal repeat）に欠損を起こしたもの。レンチウイルス野生株の5‘LTRと3' LTRは相同配列をもつ。5‘LTRと3‘LTRはウイルスゲノムの両端に同じ向きで配置される。ウイルスゲノムの挿入過程に3‘LTRの配列は5‘LTRに上書きされる。LTRはプロモーターとポリアデニレーションシグナルの両方の機能があり、野生株では5‘LTRはウイルスゲノムを転写するプロモーターとして、3‘LTRは転写終了させるためのポリアデニレーションシグナルとして機能する。当社のベクターでは、5' LTR-ΔU3はウイルスの転写因子TatがLTRのプロモーターを活性化するために必要な配列が欠損している。しかしながら、5' LTR-ΔU3 上流のRSVプロモーターが代わりにプロモーターとして機能するため、この欠損はパッケージング時のウイルスRNAの生産に影響しない。

Ψ: ウイルスRNAのパッケージングに必要なHIV-1パッケージングシグナル。

RRE: HIV-1 Rev response element。ウイルスRNAのパッケージング時のRevタンパク質によるウイルスRNAの核外輸送に必要。

cPPT: HIV-1 Central polypurine tract。細胞感染中にウイルスゲノムの核内輸送を促進させるためのDNAフラップを形成する。ベクターの宿主ゲノムへの挿入効率を上昇させ、形質転換効率を高める。

Promoter:  目的遺伝子を発現するTREプロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 発現させたい目的遺伝子。

WPRE: ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子。パッケージング細胞内のウイルスRNAの安定性を高めることで高ウイルスタイターを実現する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）や視覚化用遺伝子（EGFPなど）、もしくはデュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

3’LTR-ΔU3: HIV-1の3‘LTRのU3領域に欠損を起こしたもの。ウイルスベクター挿入過程で3' LTRが5' LTRを上書きするために、プロモーター不活性型の5' LTR-ΔU3が宿主ゲノムへ挿入される。3’LTR-ΔU3のポリアデニレーションシグナルはウイルスパッケージング中と宿主ゲノムに挿入後のすべての転写反応を停止させる。

SV40 early pA: SV40（Simian virus 40）のearlyポリアデニレーションシグナル。ウイルスパッケージング時の3' LTRによるウイルスRNA転写停止を補助する。パッケージング細胞での機能的なウイルスRNAを増加させ高ウイルスタイターを実現する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。