レンチウイルスCas9発現ベクター

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます（同様にZFNやTALENなどもよく利用されます）。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA（gRNA）と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

CRISPRによる遺伝子ターゲティングには細胞内で標的配列特異的なgRNAとCas9が共発現している必要があります。Cas9とgRNAをひとつのベクター(all-in-oneベクター)から発現させるか、Cas9とgRNAをそれぞれ独立したベクターから発現させることによって共発現が可能になります。Cas9とgRNAの発現に独立したベクターを使うメリットは、実験目的に応じて様々なgRNAとCas9（野生株Cas9、ニッケース、不活性型Cas9など）を柔軟に組み合わせて使用できる点です。加えて、Cas9発現ベクターを使ってCas9を安定して高レベル発現する細胞株を確立した後に任意のgRNAを導入することもできます。All-in-one CRISPRベクターを利用した場合よりも均質で高レベルのCas9発現が保障されているために、より効果的な遺伝子ターゲッティングが可能になります。

レンチウイルスCas9発現ベクターは遺伝子導入が困難な哺乳類動物細胞に恒久的かつ高効率なCas9導入を可能にします。レンチウイルスCas9発現ベクターはE.coliプラスミドとして作製されます。次にレンチウイルスCas9発現ベクターはヘルパープラスミドと共にパッケージング細胞に導入されます。パッケージング細胞内でベクター上の２つのLTR（long terminal repeats）のあいだのDNA領域はRNAに転写され、ヘルパープラスミドから発現したウイルスタンパク質がそのRNAをウイルスにパッケージングします。ウイルスは上清に放出され、直接もしくは濃縮後に標的細胞への感染に使用できます。標的細胞に感染したウイルスはウイルスRNAを細胞内に注入します。そしてウイルスRNAはDNAに逆転写されて宿主ゲノムへ挿入され、Cas9を発現します。

当社のレンチウイルスCas9発現ベクターはウイルスのパッケージングや感染に必要になる遺伝子群が取り除かれています。これらの遺伝子は代わりにヘルパープラスミドから提供されます。レンチウイルスベクターによって生産されるウイルスは複製不能（細胞に感染はできるが複製はできない）なので安全です。

当社ではSpCas9（Streptococcus pyogenes由来のCas9）のバリアントを多数用意していますので、実験目的に適したCas9を選択できます。Cas9バリアントとして、１）ヒトコドン使用頻度に最適化され、効率的なDSB（double-strand breaks）生成が可能なhCas9、２）DNAの一本鎖切断（ニック）のみを生成するhCas9ニッケース変異体hCas9-D10A、３）D10AとH840A変異を持つ不活性型hCas9であるdCas9、４）オフターゲット活性を減少させ、特異性を高めたSpCas9-HF1とeSpCas9を用意しています。加えて、dCas9と転写活性化ドメインの融合タンパク質であるdCas9/VP64、dCas9/VPR（CRISPRa用途）や転写抑制ドメインの融合タンパク質dCas9/KRAB（CRISPRi用途）も利用できます。その他にも、遺伝子サイズの小さいCas9バリアントが必要ならばStaphylococcus aureus由来のSaCas9や、DSB後に突出末端を生成するAcidaminococcus 由来のAsCpf1が用意されています。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

当社のレンチウイルスCas9発現ベクターは第三世代レンチウイルスベクターを基に開発されています。E.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範囲な細胞タイプへの高効率な遺伝子導入および宿主ゲノムへの挿入を実現できます。レンチウイルスCas9発現ベクターは恒常的かつ高レベルのCas9を発現して、標的配列特異的なgRNAによる高効率なCRISPRターゲッティングを実現します。当社では様々な実験目的に対応したCas9バリアントを用意しています。

柔軟性：レンチウイルスCas9発現ベクターは複数のgRNA発現ベクターと使用することで、複数のゲノムサイトを同時に標的にできます。また、FACSや薬剤選択によってCas9高発現株を確立したあとにgRNAを導入することで高効率なCRISPRターゲッティングが可能になります。

高ウイルスタイター：当社のベクターは非常に高いタイターのウイルスを作製できます（当社のウイルス作製サービスを利用すれば>10⁹ TU/mlが可能）。このレベルのタイターならば適量のウイルス上清を使うことで100％近い遺伝子導入効率が得られます。

非常に幅広い親和性：当社のウイルスパッケージングシステムはVSV-Gエンベロープタンパク質をウイルス表面に追加してあるので幅広い親和性を実現しています。その結果、すべての一般的な哺乳類といくつかの非哺乳類への遺伝子導入が可能です。さらに、ほとんどの哺乳類細胞（増殖・非増殖細胞、プライマリ細胞、接着・非接着細胞）に遺伝子を導入することも可能です。レンチウイルスベクターはアデノウイルスベクター（いくつかの細胞タイプへの形質転換効率が低い）やMMLVレトロウイルスベクター（非増殖細胞の形質転換が困難）よりも広範な親和性を持つので、従来通りの遺伝子導入法では難しかった神経細胞もレンチウイルスベクターならば確実に遺伝子導入できます。

導入コピー数にばらつきが少ない：従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法は導入されるベクターのコピー数に大きなばらつきが生じますが、一般的にウイルスによる遺伝子導入は導入されるベクターのコピー数が比較的に均一になります。

In vitroとin vivoで有効：レンチウイルスベクターは培養細胞と生体の両方に対して効果的です。

安全性：当ベクターの安全性はふたつの点から保証されます。ひとつめはウイルスのパッケージングと感染に必要な遺伝子群がヘルパープラスミドに移されていること、ふたつめは5' LTR-ΔU3はプロモーター活性をもたないので感染時にウイルスRNAが転写されません。そのために、複製可能なウイルスが発生する可能性はなく、当社のベクターを使用することによる健康へのリスクは最小限になります。

技術的な複雑さ：レンチウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

PAMが必要：CRISPR/Cas9システムはgRNA標的配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。必要なPAM配列は使用するCas9バリアントに依存します。

RSV promoter: ラウス肉腫ウイルスプロモーター。ウイルスRNAを転写する。その後ウイルスRNAはウイルスにパッケージングされる。

5’LTR-ΔU3 : HIV-1の5‘LTR（long terminal repeat）に欠損を起こしたもの。レンチウイルス野生株の5‘LTRと3' LTRは相同配列をもつ。5‘LTRと3‘LTRはウイルスゲノムの両端に同じ向きで配置される。ウイルスゲノムの挿入過程に3‘LTRの配列は5‘LTRに上書きされる。LTRはプロモーターとポリアデニレーションシグナルの両方の機能があり、野生株では5‘LTRはウイルスゲノムを転写するプロモーターとして、3‘LTRは転写終了させるためのポリアデニレーションシグナルとして機能する。当社のベクターでは、5' LTR-ΔU3はウイルスの転写因子TatがLTRのプロモーターを活性化するために必要な配列が欠損している。しかしながら、5' LTR-ΔU3 上流のRSVプロモーターが代わりにプロモーターとして機能するため、この欠損はパッケージング時のウイルスRNAの生産に影響しない。

Ψ: ウイルスRNAのパッケージングに必要なHIV-1パッケージングシグナル。

RRE: HIV-1 Rev response element。ウイルスRNAのパッケージング時のRevタンパク質によるウイルスRNAの核外輸送に必要。

cPPT: HIV-1 Central polypurine tract。細胞感染中にウイルスゲノムの核内輸送を促進させるためのDNAフラップを形成する。ベクターの宿主ゲノムへの挿入効率を上昇させ、形質転換効率を高める。

Promoter: Cas9バリアントを発現するプロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: Cas9バリアントの遺伝子。

WPRE: ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子。ウイルスRNAの3' LTRでの転写停止を促進してパッケージング細胞でのウイルスRNAを増加させ、高ウイルスタイターを実現する。さらに、Cas9遺伝子の転写停止も促進することで高い発現レベルを可能にする。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。 

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）、視覚化用遺伝子（EGFPなど）、デュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

3’LTR-ΔU3: HIV-1の3‘LTRのU3領域に欠損を起こしたもの。ウイルスベクター挿入過程で3' LTRが5' LTRを上書きするために、プロモーター不活性型の5' LTR-ΔU3が宿主ゲノムへ挿入される。3’LTR-ΔU3のポリアデニレーションシグナルはウイルスパッケージング中と宿主ゲノムに挿入後のすべての転写反応を停止させる。

SV40 early pA: SV40（Simian virus 40）のearlyポリアデニレーションシグナル。ウイルスパッケージング時の3' LTRによるウイルスRNA転写停止を補助する。パッケージング細胞でのウイルスRNAを増加させ高ウイルスタイターを実現する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。