アデノウイルスmiR30型shRNAノックダウンベクター

概要

アデノウイルスmiR30型shRNAノックダウンベクターは様々な哺乳類細胞タイプに対して安定した標的遺伝子のノックダウンを実現できます。当システムはアデノウイルスを利用して任意の遺伝子と複数のmiR30型shRNA(shRNAmiR)を含むポリシストロニック発現カセットを哺乳類細胞に導入します。shRNAmiR転写物は宿主細胞のmiRNA経路によって機能性shRNAへと変換されて標的遺伝子mRNAの分解を促進します。当ベクターはエピソームDNAとして細胞内で維持され宿主ゲノムへ挿入されないのでin vivo環境の遺伝子ノックダウン用途、遺伝子治療やワクチン接種などに適しています。

アデノウイルスmiR30型shRNAノックダウンベクターはE.coliプラスミドとして作製されます。miR30型shRNAを含むポリシストロニック発現カセットはITR(inverted terminal repeats)のあいだにクローニングされます。次にアデノウイルスmiR30型shRNAノックダウンベクターはパッケージング細胞に導入され、ITRのあいだのDNA領域がウイルスにパッケージングされます。ウイルスが標的細胞に感染すると、ウイルスゲノムは細胞核内に侵入してエピソームDNAとして維持されます。

U6のようなRNAポリメラーゼⅢプロモーターを利用する従来のshRNAベクターと異なり、miR30型shRNAはRNAポリメラーゼⅡによって発現されます。そのため組織特異性、誘導性、または転写活性の異なるプロモーターなどを利用して、恒久的に発現するU6プロモーターではできなかった実験条件が可能になります。

大きなサイズの転写産物を生産できるRNAポリメラーゼⅡは他のノックダウンベクターシステムにはない利点をもたらします。複数のshRNAmiRsを含んだポリシストロンを転写して、複数のshRNAを細胞内で同時生産することができます。これによって一つの転写産物から複数の標的遺伝子のノックダウンを実行したり、一つの遺伝子の複数部位を標的とすることでノックダウン効率を高めたりすることが可能になります。当社ではシングルshRNAとマルチshRNA発現用ベクターが用意されています。さらに、当ベクターに任意の遺伝子をshRNAmiRsと共にポリシストロンに組み込むことも可能です。この遺伝子をマーカーとして使うことでshRNA転写効率のモニターや遺伝子とshRNAの共発現が必要になる実験に利用できます。

アデノウイルスベクター上のアデノウイルス5型ゲノム(Ad5)はE1A、E1B、E3遺伝子を欠損しています(E1AとE1Bはウイルスの複製に必要)。その代わりにE1AとE1B遺伝子はパッケージング細胞に組み込まれています。そのため、当社のアデノウイルスベクターから作られるウイルスは複製不能(宿主細胞へ遺伝子の導入はできるが複製できない)であり、安全性が保障されています。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Cell Rep. 5:1704 (2013) An Optimized microRNA Backbone for Effective Single-Copy RNAi
Proc Natl Acad Sci U S A. 91:8802 (1994) The 2nd generation adenovirus vectors
J Gen Virol. 36:59 (1977) A packaging cell line for adenovirus vectors
J Virol. 79:5437 (2005) Replication-competent adenovirus (RCA) formation in 293 Cells
Gene Ther. 3:75 (1996) A cell line for testing RCA

特徴

当社のアデノウイルスmiR30型shRNAノックダウンベクターはアデノウイルス5型(Ad5)を基に開発され、遺伝子ノックダウンのために最適化されたmiRNAシステムが組み込まれています。E.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範な細胞タイプへの高い遺伝子導入効率および宿主ゲノムへの挿入効率を実現します。任意のプロモーターによって任意の遺伝子と複数shRNAmiRsをポリシストロニック転写産物として発現できます。shRNAmiRsは効率的なshRNA生産と標的遺伝子のノックダウンを実現する、最適化されたmiR30配列を持ちます。

メリット

プロモーターが選択可能: U6のようなRNAポリメラーゼⅢプロモーターを利用するshRNAシステムとは異なり、当システムではRNAポリメラーゼⅡ用プロモーターが採用されています。そのため、組織特異性プロモーターや誘導性プロモーターなどを利用してmirR30型shRNAを発現できます。

複数shRNA同時発現:RNAポリメラーゼⅡは大きなサイズのRNAを転写することができるので、単一プロモーターから複数shRNAmiRをポリシストロンとして発現させることができます。シングルshRNAとマルチshRNA発現用ベクターが用意されています。

レポーター遺伝子の共発現:任意の遺伝子もしくはレポーター遺伝子をshRNAmiRと共にポリシストロンとして発現することができます。レポーター遺伝子はshRNA転写量モニタリングに利用できます。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い:宿主細胞に感染したアデノウイルスベクターは細胞核内でエピソームDNAとして維持されます。ゲノムへの挿入が起こらないために、ゲノムの損傷よる癌化の可能性が低く、ヒト生体に使用する用途に適しています。

非常に高いウイルスタイター: アデノウイルスベクターをパッケージング細胞に導入して作製したウイルスをパッケージング細胞に再感染させることでウイルスを増幅して非常に高いタイターを得られます。このような増幅はレンチウイルス、MMLVレトロウイルス、AAVなどではできません。当社のアデノウイルス作製サービスを利用していただければ、1011 PFU/ml(plaque-forming unit per ml)以上のタイターを得ることができます。

幅広い親和性:ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類動物由来の細胞に遺伝子を導入できます。ただし、いくつかの細胞タイプへの遺伝子導入は困難であることが知られています。

In vitroとin vivoで有効:培養細胞と生体内の細胞に対しても使用できます。

安全性:当ベクターからはウイルス作製に必須の遺伝子が取り除かれているため(それらの遺伝子はパッケージング細胞のゲノムに組み込まれています)、当ベクターから作られるウイルスは複製不能であり安全です。

デメリット

ベクターDNAがゲノムに挿入されない:アデノウイルスゲノムは宿主のゲノムに挿入されずにエピソームDNAとして維持されます。そのため、エピソームDNAは時間経過とともに失われます。特に増殖細胞では顕著になります。

特定の細胞タイプへの遺伝子導入が困難:アデノウイルスベクターは非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能ですが、特定の細胞タイプ(内皮細胞、平滑筋、気道上皮細胞、末梢血細胞、神経細胞、造血細胞など)に対する導入効率は低くなります。

強い免疫原性: アデノウイルスベクターから作成されたウイルスは動物生体内で強い免疫反応を引き起こすことがあるので、特定のin vivo用途には制限があります。

技術的な複雑さ:アデノウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

基本コンポーネント

アデノウイルス シングルmiR30型shRNAノックダウンベクター

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

Ψ: アデノウイルスゲノムDNAのパッケージングシグナル。

Promoter: 下流の遺伝子とshRNAmiR をポリシストロンとして転写する。U6のようなRNA polymerase III ではなくRNA polymerase IIプロモーターが使われる。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 任意の遺伝子もしくはレポーター遺伝子を配置する。shRNA発現モニタリングにも利用可能。

5' miR-30E: 最適化されたヒトmiR30 5’関連配列。shRNAプロセシングと成熟、そしてポリシストロンからの切断分離を促進する。

3' miR-30E: 最適化されたヒトmiR30 3’関連配列。shRNAプロセシングと成熟、そしてポリシストロンからの切断分離を促進する。

miR30-shRNA: ノックダウン標的配列から設計され、shRNAヘアピン構造のステム部分を形成する。

TK pA: 単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのポリアデニレーションシグナル。上流ORFとshRNAmiRのポリシストロンの転写を停止する。

ΔAd5: アデノウイルス5型(Ad5)ゲノム。E1A、E1B、E3領域が欠損している。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

pBR322 ori: pBR322複製起点。E.coliでプラスミドを中コピー数で維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

PacI: PacI制限酵素認識サイト(TTAATTAA)。2ヵ所のPacIサイトで切断することによってベクターを線状化し、ベクターバックボーンを取り除いて効率的なパッケージングを実現する。

アデノウイルス マルチmiR30型shRNAノックダウンベクター

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

Ψ: アデノウイルスゲノムDNAのパッケージングシグナル。

Promoter: 下流の遺伝子とshRNAmiR をポリシストロンとして転写する。U6のようなRNA polymerase III ではなくRNA polymerase IIプロモーターが使われる。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 任意の遺伝子もしくはレポーター遺伝子を配置する。shRNA発現モニタリングにも利用可能。

5' miR-30E: 最適化されたヒトmiR30 5’関連配列。shRNAプロセシングと成熟、そしてポリシストロンからの切断分離を促進する。

3' miR-30E: 最適化されたヒトmiR30 3’関連配列。shRNAプロセシングと成熟、そしてポリシストロンからの切断分離を促進する。

miR30-shRNA#1: ノックダウン標的配列(#1)から設計され、shRNAヘアピン構造のステム部分を形成する。

miR30-shRNA#2: ノックダウン標的配列(#2)から設計され、shRNAヘアピン構造のステム部分を形成する。

miR30-shRNA#3: ノックダウン標的配列(#3)から設計され、shRNAヘアピン構造のステム部分を形成する。

miR30-shRNA#4: ノックダウン標的配列(#4)から設計され、shRNAヘアピン構造のステム部分を形成する。

TK pA: 単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのポリアデニレーションシグナル。上流ORFとshRNAmiRのポリシストロンの転写を停止する。

ΔAd5: アデノウイルス5型(Ad5)ゲノム。E1A、E1B、E3領域が欠損している。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

pBR322 ori: pBR322複製起点。E.coliでプラスミドを中コピー数で維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

PacI: PacI制限酵素認識サイト(TTAATTAA)。2ヵ所のPacIサイトで切断することによってベクターを線状化し、ベクターバックボーンを取り除いて効率的なパッケージングを実現する。