アデノウイルスgRNA 発現ベクター

概要

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます(同様にZFNやTALENなどもよく利用されます)。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA(gRNA)と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

CRISPRによる遺伝子ターゲティングには細胞内で標的配列特異的なgRNAとCas9が共発現している必要があります。Cas9とgRNAをひとつのベクター(all-in-oneベクター)から発現させるか、Cas9とgRNAをそれぞれ独立したベクターから発現させることによって共発現が可能になります。Cas9とgRNAの発現に独立したベクターを使うメリットは、実験目的に応じて様々なgRNAとCas9(野生株Cas9、ニッケース、不活性型Cas9など)を柔軟に組み合わせて使用できる点です。さらに、あらかじめ高レベルかつ安定してCas9を発現している細胞もしくは生体に対して様々な標的配列をもつgRNA発現ベクターを導入できます。この方法ならば、それぞれのgRNAが同じ細胞もしくは生体に対してどのくらいの遺伝子ターゲティング効率を持っているのかを比較検討できます。

アデノウイルスgRNA発現ベクターは多様な哺乳類動物細胞にgRNAを導入できます。ベクターは宿主ゲノムへ挿入されずにエピソームDNAとして維持されるために、アデノウイルスは遺伝子治療やワクチン接種などの用途に適しています。アデノウイルスgRNA発現ベクターはE.coliプラスミドとして作製されます。ヒトU6プロモーターを含むgRNA発現カセットはITR(inverted terminal repeats)のあいだにクローニングされます。次にアデノウイルスgRNA発現ベクターはヘルパープラスミドと共にパッケージング細胞に導入され、ITRのあいだの領域がウイルスにパッケージングされます。標的細胞に感染したウイルスのゲノムは細胞核内でエピソームDNAとして維持されます。

アデノウイルスgRNA発現ベクターは実験目的に応じてシングルgRNA発現用とデュアルgRNA発現用のどちらかを選択できます。シングルgRNA発現ベクターはgRNA発現用のヒトU6プロモーターをひとつ、デュアルgRNA発現ベクターはふたつ持ちます。シングルgRNA発現ベクターは遺伝子ノックアウトなどの従来のCRISPRゲノム編集用途に利用され、デュアルgRNA発現ベクターは対となるゲノムサイトを同時に標的とする必要がある用途に利用されます。使用用途として次のようなケースがあります。1)標的サイトに対してペアとなるgRNAとhCas9ニッケース変異体(hCas9-D10A)を使用して、二本鎖DNAのそれぞれの鎖にニック(一本鎖切断)を入れてDSB(double strand break:二本鎖切断)を起こしてゲノム編集を実行する。2)対となるgRNAペアを利用して2ヵ所のDSBを作り出し、そのあいだの配列の欠失を作り出す。3)2つのgRNAによる2つの遺伝子の同時編集。

アデノウイルスgRNA発現ベクター上のアデノウイルス5型ゲノム(Ad5)はE1A、E1B、E3遺伝子を欠損しています(E1AとE1Bはウイルスの複製に必要)。その代わりにE1AとE1B遺伝子はパッケージング細胞に組み込まれています。そのため、当社のアデノウイルスgRNA発現ベクターから作られるウイルスは複製不能(宿主細胞へ遺伝子の導入はできるが複製できない)であり、安全性が保障されています。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Science. 339:819 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Cell. 154:1380–9 (2013) Use of Cas9 D10A double nicking for increased specificity
Sci. Rep. 4:5105 (2014) CRISPR/Cas9 targeting using adenoviral gRNA expressing vectors
Plos One. 12: e0187236 (2017) CRISPR/Cas9 vectors for dual gRNA expression

特徴

当社のアデノウイルスgRNA発現ベクターはアデノウイルス5型(Ad5)を基に開発されています。E.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範囲な細胞タイプへの高効率な導入および導入遺伝子の高い発現量を実現します。ヒトU6プロモーターからの恒常的かつ高レベルのgRNA発現と高効率なCRISPRターゲッティングを実現します。さらに、標的とするゲノムサイトの数に応じてシングルgRNA発現用ベクターまたはデュアルgRNA発現用ベクターを選択できます。

メリット

柔軟性:当社のレンチウイルスgRNA発現ベクターは実験目的に応じて多様なCas9バリアント(ヌクレアーゼ、ニッケース、不活性型)と組み合わせて使用できます。さらに、シングルgRNAもしくはデュアルgRNAを発現できるベクターを標的サイトの数に応じて選択できます。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い:宿主細胞に感染してもアデノウイルスベクターは細胞核内でエピソームDNAとして維持されます。ゲノムへの挿入が起こらないために、ゲノムの損傷よる癌化の可能性が低く、ヒト生体に使用する用途などに理想的です。

非常に高いウイルスタイター: アデノウイルスベクターをパッケージング細胞に導入してウイルスを作製した後に、パッケージング細胞に再感染させることでウイルスを増幅して非常に高いタイターを得られます。このような増幅はレンチウイルス、MMLVレトロウイルス、AAVなどではできません。当社のアデノウイルス作製サービスを利用していただければ、1011 PFU/ml(plaque-forming unit per ml)以上のタイターを得ることができます。

幅広い親和性:ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類動物由来の細胞に遺伝子を導入できます。ただし、いくつかの細胞タイプへの遺伝子導入は困難であることが知られています。

In vitroとin vivoで有効:培養細胞と生体内の細胞に対しても使用できます。

安全性:当ベクターからはウイルス作製に必須の遺伝子が取り除かれているため(それらの遺伝子はパッケージング細胞のゲノムに組み込まれています)、当ベクターから作られるウイルスは複製不能であり安全です。

デメリット

ベクターDNAがゲノムに挿入されない:アデノウイルスゲノムは宿主のゲノムに挿入されずにエピソームDNAとして維持されます。そのため、エピソームDNAは時間経過とともに失われます。

特定の細胞タイプへの遺伝子導入が困難:アデノウイルスベクターは非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能ですが、特定の細胞タイプ(内皮細胞、平滑筋、気道上皮細胞、末梢血細胞、神経細胞、造血細胞など)に対する導入効率は低くなります。

強い免疫原性: アデノウイルスベクターから作成されたウイルスは動物生体内で免疫反応を引き起こすことがあるので、特定のin vivo用途には制限があります。

技術的な複雑さ:アデノウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

PAMが必要:CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。

基本コンポーネント

シングルgRNAアデノウイルスgRNA発現ベクター

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

Ψ: アデノウイルスゲノムDNAのパッケージングシグナル。

U6 promoter: ヒトU6 snRNAのプロモーター。small RNAの転写をするRNAポリメラーゼIIIによってgRNAを高レベルで発現する。

gRNA: 使用されるCas9バリアントに応じたgRNA。

Terminator: gRNAの転写を停止する。

hPGK promoter: ヒトphosphoglycerate kinase 1 遺伝子プロモーター。下流のマーカー遺伝子を遍在的に発現する。

Marker:視覚化用遺伝子(EGFPなど)。ベクターが導入された細胞を可視化する。

TK pA: 単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

ΔAd5: アデノウィルス5型(Ad5)ゲノム。E1A、E1B、E3領域が欠損している。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

pBR322 ori: pBR322複製起点。E.coliでプラスミドを中コピー数で維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

PacI: PacI制限酵素認識サイト(TTAATTAA)。2ヵ所のPacIサイトで切断することによってベクターを線状化し、ベクターバックボーンを取り除いて効率的なパッケージングを実現する。

デュアルgRNAアデノウイルス発現ベクター

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

Ψ: アデノウイルスゲノムDNAのパッケージングシグナル。

U6 promoter: ヒトU6 snRNAのプロモーター。small RNAの転写をするRNAポリメラーゼIIIによってgRNAを高レベルで発現する。

gRNA #1: 使用されるCas9バリアントに応じたgRNA#1。

gRNA #2: 使用されるCas9バリアントに応じたgRNA#2。

Terminator: gRNAの転写を停止する。

hPGK promoter: ヒトphosphoglycerate kinase 1 遺伝子プロモーター。下流のマーカー遺伝子を遍在的に発現する。

Marker:視覚化用遺伝子(EGFPなど)。ベクターが導入された細胞を可視化する。

TK pA: 単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

ΔAd5: アデノウィルス5型(Ad5)ゲノム。E1A、E1B、E3領域が欠損している。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

pBR322 ori: pBR322複製起点。E.coliでプラスミドを中コピー数で維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

PacI: PacI制限酵素認識サイト(TTAATTAA)。2ヵ所のPacIサイトで切断することによってベクターを線状化し、ベクターバックボーンを取り除いて効率的なパッケージングを実現する。