アデノウイルスCRISPRベクター

概要

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます(同様にZFNやTALENなどもよく利用されます)。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA(gRNA)と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

CRISPRによる遺伝子ターゲティングは細胞内で標的配列特異的なgRNAとCas9が共発現している必要があります。Cas9とgRNAをひとつのベクター(all-in-oneベクター)から発現させるか、Cas9とgRNAをそれぞれ独立したベクターから発現させることによって共発現が可能になります。all-in-oneベクターを使うメリットは、CRISPRゲノム編集に必要なすべてのコンポーネントをひとつのベクターのみで供給でき、技術的に簡便である点です。独立したgRNAベクターとCas9ベクターの同時導入を試みても、両ベクターがすべての細胞に同時に導入される確率は大変低くなります。別の方法としてCas9を安定して大量に発現する細胞もしくは生体にgRNAを発現させる方法がありますが、かなりの時間と労力が必要になります。当社のall-in-oneベクターはCas9とgRNAをアデノウイルスベクターから発現できるため上記の困難を回避できます。

アデノウイルスCRISPRベクターは幅広い哺乳類細胞にCas9とgRNAを同時に導入できます。ベクターは宿主ゲノムへ挿入されずにエピソームとして維持されるため、遺伝子治療やワクチン接種などの生体への遺伝子導入用途に適しています

手始めにアデノウイルスCRISPRベクターはE.coliのプラスミドとして作製されます。Cas9とgRNA発現カセットは両端をITR(inverted terminal repeats)に挟まれる形でクローニングされます。gRNAはヒトU6プロモーターから発現されてCas9を標的ゲノムサイトへ誘導します。アデノウイルスCRISPRベクターがパッケージング細胞に導入されると、ITRのあいだの領域がウイルスにパッケージングされます。アデノウイルスが標的細胞に感染すると、ウイルスDNAは細胞核内に入り込み、エピソームDNAとして維持されます(宿主ゲノムへ挿入されない)。

アデノウイルスCRISPRベクターは実験目的に応じてシングルgRNA発現用とデュアルgRNA発現用のどちらかを選択できます。シングルgRNA発現ベクターはgRNA発現用のヒトU6プロモーターをひとつ、デュアルgRNA発現ベクターはふたつ持ちます。シングルgRNA発現ベクターは遺伝子ノックアウトなどの従来のCRISPRゲノム編集用途に利用され、デュアルgRNA発現ベクターは対となるゲノムサイトを同時に標的とする必要がある用途に利用されます。使用用途として次のようなケースがあります。1)標的サイトに対してペアとなるgRNAとhCas9ニッケース変異体(hCas9-D10A)を使用して、二本鎖DNAのそれぞれの鎖にニック(一本鎖切断)を入れてDSB(double strand break:二本鎖切断)を起こしてゲノム編集を実行する。2)対となるgRNAペアを利用して2ヵ所のDSBを作り出し、そのあいだの配列の欠失を作り出す。3)2つのgRNAによる2つの遺伝子の同時編集。

アデノウイルスCRISPRベクターのアデノウイルス5型ゲノム(Ad5)はE1A、E1B、E3遺伝子を欠損しています。E1AとE1Bはウイルスの複製に必要です。E1AとE1B遺伝子はパッケージング細胞に組み込まれています。そのため、当社のアデノウイルスCRISPRベクターから作られるウイルスは複製不能(宿主細胞へ遺伝子の導入はできるが複製できない)であり、安全性が保障されています。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Science. 339:819 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Cell. 154:1380–9 (2013) Use of Cas9 D10A double nicking for increased specificity
Nat. Biotech. 31:827 (2013) Specificity of RNA-guided Cas9 nucleases
Sci Rep. 9:277 (2019) CRISPR/Cas9 targeting using an all-in-one adenoviral vector

特徴

当社のアデノウイルスCRISPRベクターはアデノウイルス5型(Ad5)を基に開発されています。E.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範囲な細胞タイプへの高効率な導入および導入遺伝子の高い発現量を実現します。このアデノウイルスCRISPRベクターはひとつのベクターからCas9とgRNAを発現できるように設計されています。さらに、標的とするゲノムサイトの数に応じてシングルgRNA発現用ベクターまたはデュアルgRNA発現用ベクターを選択できます。

メリット

簡便さ: CRISPR/Cas9はgRNAと標的ゲノムサイトの配列の相同性によって機能するために、設計が簡単で分かりやすくなっています。当社のアデノウイルスCRISPRベクターはCas9とgRNAを哺乳類細胞に同時に導入できるように設計されています。これによってCRISPR遺伝子編集に必要なすべてのコンポーネントを一度に導入できるので、Cas9とgRNAを独立したベクターで導入するよりも簡便で時間を節約できます。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い:宿主細胞に感染してもアデノウイルスベクターは細胞核内でエピソームDNAとして維持されます。ゲノムへの挿入が起こらないために、ゲノムの損傷よる癌化の可能性が低く、ヒト生体を扱う用途などに理想的です。

非常に高いウイルスタイター: アデノウイルスベクターをパッケージング細胞に導入してウイルスを作製した後に、再びパッケージング細胞に感染させることでウイルスを増幅して非常に高いタイターを得られます。このような増幅はレンチウイルス、MMLVレトロウイルス、AAVなどではできません。当社のアデノウイルス作製サービスを利用していただければ、1011 PFU/ml(plaque-forming unit per ml)以上のタイターを得ることができます。

幅広い親和性:ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類動物由来の細胞に遺伝子を導入できます。ただし、いくつかの細胞タイプへの遺伝子導入は困難であることが知られています。

In vitroとin vivoで有効:培養細胞と生体内の細胞に対しても使用できます。

安全性:当ベクターからはウイルス作製に必須の遺伝子が取り除かれています(それらの遺伝子はパッケージング細胞のゲノムに組み込まれています)。当ベクターから作られるウイルスは複製不能であるために安全性が保障されています。

デメリット

ベクターDNAがゲノムに挿入されない:アデノウイルスゲノムは宿主のゲノムに挿入されずにエピソームDNAとして維持されます。そのため、エピソームDNAは時間経過とともに失われます。

特定の細胞タイプへの形質転換が困難:アデノウイルスベクターは非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能ですが、特定の細胞タイプ(内皮細胞、平滑筋、気道上皮細胞、末梢血細胞、神経細胞、造血細胞など)に対する導入効率は低くなります。

強い免疫原性: アデノウイルスベクターから作成されたウイルスは動物生体内で免疫反応を引き起こすことがあるので、特定のin vivo用途には制限があります。

技術的な複雑さ:アデノウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

オフターゲット活性:CRISPR/Cas9システムではある程度のオフターゲット活性があります。一般的にはTALENシステムの方が低いオフターゲット活性を持つといわれています。しかしながら、標的のゲノムサイトに対してhCas9-D10AニッケースとgRNAを2つ使用して2本鎖DNAのそれぞれの鎖に対してニックをいれ、DSBを作り出す方法ならばオフターゲット活性を大幅に減少させることができます。

PAMが必要:CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。

基本コンポーネント

シングルgRNA アデノウィルスCRISPR ベクター

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

Ψ: アデノウイルスゲノムDNAのパッケージングシグナル。

U6 promoter: ヒトU6 snRNAのプロモーター。small RNAの転写をするRNAポリメラーゼIIIによってgRNAを高レベルで発現する。

gRNA: Streptococcus pyogenes由来のCas9(SpCas9)用のgRNA。

Terminator: gRNAの転写を停止する。

CBh promoter: チキン β‐アクチンプロモーター。下流のCas9ヌクレアーゼを発現する。

Cas9 protein: Cas9遺伝子。

TK pA: 単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

ΔAd5: アデノウィルス5型(Ad5)ゲノム。E1A、E1B、E3領域が欠損している。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

pBR322 ori: pBR322複製起点。E.coliでプラスミドを中コピー数で維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

PacI: PacI制限酵素認識サイト(TTAATTAA)。2ヵ所のPacIサイトで切断することによってベクターを線状化し、ベクターバックボーンを取り除いて効率的なパッケージングを実現する。

デュアルgRNA アデノウィルスCRISPR ベクター

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

Ψ: アデノウイルスゲノムDNAのパッケージングシグナル。

U6 promoter: ヒトU6 snRNAのプロモーター。small RNAの転写をするRNAポリメラーゼIIIによってgRNAを高レベルで発現する。

gRNA #1: Streptococcus pyogenes由来のCas9用のgRNA#1。

gRNA #2: Streptococcus pyogenes由来のCas9用のgRNA#2。

Terminator: gRNAの転写を停止する。

CBh promoter: チキン β‐アクチンプロモーター。下流のCas9ヌクレアーゼを発現する。

Cas9 protein: Cas9遺伝子。

TK pA: 単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

ΔAd5: アデノウイルス5型(Ad5)ゲノム。E1A、E1B、E3領域が欠損している。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

pBR322 ori: pBR322複製起点。E.coliでプラスミドを中コピー数で維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

PacI: PacI制限酵素認識サイト(TTAATTAA)。2ヵ所のPacIサイトで切断することによってベクターを線状化し、ベクターバックボーンを取り除いて効率的なパッケージングを実現する。