Vector Systems
AAV CRISPR転写活性化（SAMシステム）ベクター
概要
CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます。（ZFNやTALENなどもよく使われています）。
Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA（gRNA）と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。
SAM（Synergistic Activation Mediator）システムはゲノムの遺伝子座で遺伝子発現を活性化できる強力なツールです。SAMシステムはCRISPR/Cas9ゲノム編集システムの派生型ですが、改良されたgRNAはゲノム編集ではなく、転写活性化複合体であるSAM複合体の形成を誘導します。SAM複合体の形成によって標的サイトで強力な転写活性化が起こります。
AAV用SAMシステムは３つのコンポーネント（SagRNA/MS2、MS2/P65/HSF1、dSaCas9/VP64）から構成され、2つの独立したAAVベクターに組み込まれています。標的配列に特異的なSagRNA（Staphylococcus aureus Cas9用のgRNA）はAAV msSagRNA発現ベクターにクローニングされます。SagRNAはバクテリオファージMS2 coatタンパク質の結合サイトとなる2つの138ntヘアピンRNAアプタマーとつなげられ、MS2融合タンパク質を効率的に引き寄せます。加えてAAV msSagRNA発現ベクターは3ドメイン（MS2、p65 (NF-kBトランスアクティベーターサブユニット)、HSF1 (ヒトHeat shock factor 1活性化ドメイン)）から構成されるMS2融合タンパク質（MS2/P65/HSF1）を発現します。AAV dSaCas9/VP64ヘルパーベクターは不活性型のSaCas9（dSaCas9）とVP64転写活性化因子との融合タンパク質を発現します。
この２つのベクターを細胞に導入すると、SagRNAがMS2/P65/HSF1（RNAアプタマーとMS2の相互作用によって）とdSaCas9/VP64（SagRNAとCRISPR/Cas9複合体形成によって）を標的配列に引き寄せてSAM複合体を形成します。SAM複合体はVP64、p65、HSF1の相互作用による相乗効果によって強力な転写活性化をします。
当社のAAV msSagRNAベクターはStaphylococcus aureus 由来のSaCas9を基にして開発されています。SaCas9は従来のStreptococcus pyogenes由来のSpCas9よりも1kbほど小さい遺伝子サイズを持ちます。許容できるDNAサイズが限定されるAAVベクターではSpCas9は遺伝子サイズが大きいために使いにくいですがSaCas9はその点でメリットがあります。SaCas9とSpCas9はgRNAのscafold配列に違いがあり、またSaCas9のPAM配列はNNGRRT（SpCas9はNGG）となります。
当ベクターシステムはgRNA配列ライブラリーを利用してgRNA/MS2発現ベクターライブラリーを作製してゲノム遺伝子座の大規模スクリーニングをするために設計されています。もちろん、当システムを使って個々の遺伝子もしくは少量の遺伝子セットの発現を活性化することも可能です。
AAVの大きな利点として、AAVは複製不能かつ炎症反応などのヒトの疾患の原因とならないのでバイオセーフティレベル1の研究室で扱うことができる点です。AVVは宿主生物において低い免疫原性をもつために、当社のAAV msSagRNA発現ベクターはin vivoでCRISPRを扱う実験に理想的です。
これまでに多様なAAV株が確認されています。それらはウイルス表面のカプシドタンパク質に違いがあり、それによる血清型で分類されます。ウイルス感染の組織親和性は血清型に依存します。当社のAAVベクターをウイルスにパッケージングする時にはそれぞれのカプシドタンパク質を選択することで任意の血清型をウイルスに持たせることができます。
下記の表はAAV血清型と組織親和性の対応を記載しています。
セロタイプ別
組織別
| Serotype | Tissue tropism |
|---|---|
| AAV1 | 平滑筋, 骨格筋, 中枢神経系, 脳, 肺, 網膜, 内耳, 膵臓, 心臓, 肝臓 |
| AAV2 | 平滑筋, 中枢神経系, 脳, 肝臓, 膵臓, 腎臓, 網膜, 内耳, 精巣 |
| AAV3 | 平滑筋, 肝臓, 肺 |
| AAV4 | 中枢神経系, 網膜, 肺, 腎臓, 心臓 |
| AAV5 | 平滑筋, 中枢神経系, 脳, 肺, 網膜, 心臓 |
| AAV6 | 平滑筋, 心臓, 肺, 膵臓, 脂肪, 肝臓 |
| AAV6.2 | 肺, 肝臓, 内耳 |
| AAV7 | 平滑筋, 網膜, 中枢神経系, 脳, 肝臓 |
| AAV8 | 平滑筋, 中枢神経系, 脳, 網膜, 内耳, 肝臓, 膵臓, 心臓, 腎臓, 脂肪 |
| AAV9 | 平滑筋, 骨格筋, 肺, 肝臓, 心臓, 膵臓, 中枢神経系, 網膜, 内耳, 精巣, 肝臓, 脂肪 |
| AAVrh10 | 平滑筋, 肺, 肝臓, 心臓, 膵臓, 中枢神経系, 網膜, 腎臓 |
| AAV-DJ | 肝臓, 心臓, 腎臓, 脾臓 |
| AAV-DJ/8 | 肝臓, 脳, 腎臓, 脾臓 |
| AAV-PHP.eB | 中枢神経系 |
| AAV-PHP.S | 末梢神経系 |
| AAV2-retro | 脊髄神経 |
| AAV2-QuadYF | 内皮細胞, 網膜 |
| AAV2.7m8 | 網膜, 内耳 |
| Tissue type | Recommended AAV serotypes |
|---|---|
| 平滑筋 | AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
| 骨格筋 | AAV1, AAV9 |
| 中枢神経系 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB |
| 末梢神経系 | AAV-PHP.S |
| 脳 | AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8 |
| 網膜 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8 |
| 内耳 | AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8 |
| 肺 | AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10 |
| 肝臓 | AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 膵臓 | AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
| 心臓 | AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ |
| 腎臓 | AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 脂肪 | AAV6, AAV8, AAV9 |
| 精巣 | AAV2, AAV9 |
| 脾臓 | AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 脊椎神経 | AAV2-retro |
| 内皮細胞 | AAV2-QuadYF |
当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください
| References | Topic |
|---|---|
| Cell. 154:442 (2013) | Characterization of CRISPRa and CRISPRi systems |
| Nature. 517:583 (2015) | Description of the SAM system |
| Genome Biol. 16:257 (2015) | Characterization of Staphylococcus aureus Cas9 |
| Nature. 520:186 (2015) | In vivo genome editing with SaCas9-based AAV vectors |
特長
当社のAAVベクターシステムはE.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルスパッケージング、高い形質転換効率、そして導入された遺伝子の高い発現量を達成できます。AAVベクターは高い安全性とパッケージング時にすべてのカプシドタンパク質の血清型を選択できるため、非常に高効率な遺伝子導入を実現できます。
メリット
ゲノム配列の改変をしない：SAMシステムはゲノム上の標的遺伝子座の転写を活性化できます。ゲノム編集や外来性遺伝子の導入などとは異なり、ゲノム配列の改変を行うことはありません。
生理学的制御とは無関係：SAMシステムを利用すれば標的遺伝子の転写制御についての予備知識がなくても転写活性化が可能です。標的の配列情報は必要になります。
強力な転写活性化：標的遺伝子の高レベルな発現を達成できます。
デメリット
細胞タイプによっては遺伝子導入が困難: 当社のAAVベクターシステムは適切な血清型を選択することで幅広い細胞タイプ（非増殖細胞含む）に対して使用できます。しかしながら、血清型はそれぞれに異なる組織親和性をもち、いくつかの細胞タイプはどの血清型を選択しても遺伝子導入が難しいものがあります。
技術的な複雑さ：ウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。
PAM配列が必要：当社のAAV msSagRNAベクターはStaphylococcus aureus由来のSaCas9 を利用しています。SaCas9によるCRISPRはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAM配列NNGRR（NNGRRTのほうが好ましい）が必要になります。
特異性：SAMシステムを利用した遺伝子発現の活性化はまだ新しい技術なのでSagRNA/MS2 RNAsの特異性ついての詳細な情報はわかっていません。
基本コンポーネント
5' ITR: 5' inverted terminal repeat。ウイルス野生株の5'ITRと3'ITRは相同配列を持つ。両ITRはたがいに向き合う形でウイルスゲノムの両端に位置して、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。
U6 Promoter: ヒトU6 snRNAのプロモーター。small RNAの転写をするRNAポリメラーゼIIIによってgRNAを高レベルで発現する。
msSagRNA：SaCas9用のscafold配列を含むgRNAとMS2バクテリオファージcoatタンパク質融合タンパク質が結合するヘアピンアプタマー配列に連結されている。
Terminator: SagRNAの転写を停止する。
EF1A promoter: ヒト真核生物翻訳伸長因子１ アルファ１プロモーター。MS2/P65/HSF1転写調節タンパク質の遍在的発現を誘導する。
Regulatory protein: MS2、p65 (NF-kBトランスアクティベーターサブユニット)、HSF1 (ヒトHeat shock factor 1活性化ドメイン)から構成されるMS2融合タンパク質（MS2/P65/HSF1）。
BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。
3' ITR: 3' inverted terminal repeat。5' ITRを参照。
Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。
pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。