AAV Tet-On誘導性遺伝子発現ベクター

AAV Tet-On誘導性遺伝子発現ベクターはベクタービルダー社の信頼性の高いAAVベクターシステムとTet-On誘導性遺伝子発現システムを組み合わせることによって、AAVを利用したテトラサイクリン遺伝子発現誘導カセットのin vitroおよびin vivo導入を可能にしました。

Tet-On誘導性遺伝子発現システムは哺乳類細胞で目的遺伝子の発現タイミングを制御できる強力なツールです。当社のTet-On誘導性遺伝子発現ベクターはテトラサイクリン（もしくはドキシサイクリンなどのアナログ）非存在条件下のほぼ完全な遺伝子発現抑制とテトラサイクリンの添加に応じた目的遺伝子の強力かつ素早い発現誘導を実現します。当システムはテトラサイクリン非存在下のtTSタンパク質による能動的な発現抑制効果とテトラサイクリン存在下のrtTAタンパク質による強力な発現誘導効果が組み合わされています。TetR（Tet抑制タンパク質）とKRAB-AB（Kid1タンパク質の転写抑制ドメイン）の融合タンパク質であるtTSはテトラサイクリン非存在条件でTREプロモーターに結合し、遺伝子の転写を抑制します。一方で、Tet抑制タンパク質の変異体とVP16（単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質の転写活性化ドメイン）との融合タンパク質であるrtTAはテトラサイクリン存在条件でTREプロモーターに結合して遺伝子の転写を活性化します。

AAV誘導性遺伝子発現ベクターはE.coliプラスミドとして作製され、目的遺伝子の発現するテトラサイクリン応答性（TRE）プロモーターとtTS/rtTA制御タンパク質を発現する遍在的もしくは組織特異的プロモーターから構成されているテトラサイクリン誘導性遺伝子発現カセットは2つのITRのあいだにクローニングされます。続いてAAV誘導性遺伝子発現ベクターはヘルパープラスミドとともにパッケージング細胞に導入され、ITRのあいだのDNA配列がウイルスにパッケージングされます。目的遺伝子の発現はテトラサイクリン存在条件で誘導されます。

AAVは多くの哺乳類細胞タイプへの遺伝子導入に効果的であることに加えて、アデノウイルスと異なり免疫原性が非常に低く、ほとんど病原性がありません。そのためAAV誘導型遺伝子発現ベクターはin vivo環境で遺伝子発現を誘導する用途に適しています。

AAV野生株のゲノムはssAAVと呼ばれる線状の一本鎖DNA（ssDNA）であり、両端にヘアピン構造を持つITRを持ちます。ssAAV上の遺伝子が発現するためにはまず、2つの経路によって二本鎖DNAに変換される必要があります。１）DNAポリメラーゼがssDNAゲノムをテンプレート、3' ITRを複製開始サイトとして相補鎖を複製する。２）ssAAVゲノムのあいだで＋鎖と－鎖のあいだの分子間ハイブリダイゼーションによって2本鎖DNAを作り出す。二本鎖DNAへの変換は主に１）の経路によってなされます

AAVゲノムDNAは宿主細胞の核内で連結した（コンカテマー）エピソームDNAとして維持されます。エピソームDNAは宿主ゲノム内で複製されないので、AAVゲノムは非増殖細胞では宿主細胞内で維持されますが、増殖細胞では細胞分裂によって希釈されて最終的には消失します。AAVゲノムが宿主ゲノムに挿入されることは非常に稀です。それゆえベクターの挿入によって細胞が癌化する懸念がないのでAAVベクターは遺伝子治療などの用途に適しています。

AVVは複製不能でヒトに対して炎症反応などの疾患の原因にほとんどならないために、バイオセーフティレベル1の施設で扱うことができ、非常に実用性が高いシステムです。AAVは宿主生体内での免疫原性が低く、様々な動物実験に理想的なウイルスベクターです。

自然界から単離された複数のAAV株は、ウイルス表面のカプシドタンパク質の抗原性に基づいた血清型で分類できます。血清型によってウイルスの親和性（感染の組織特異性）が変わります。AAVベクターをパッケージングする際には異なるカプシドタンパク質を選択することでウイルスの血清型を変更することができます。クローニングの際、特異性に影響を与えないためにこの分野では一般的であるAAV2由来のITRが使用されています。パッケージング用のヘルパープラスミドにはRep/Capプラスミドがあり、AAV2由来の複製遺伝子と選択した血清型のカプシドタンパク質を含み、指向性を決定します。AAVの血清型と組織親和性の対応については下記の表をご覧ください。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

当社のAAV Tet-On誘導性遺伝子発現ベクターはテトラサイクリン非存在条件下の目的遺伝子のほぼ完全な発現抑制と、テトラサイクリン添加に応じた強力かつ素早い発現誘導を可能にします。AAV誘導型遺伝子発現ベクターはE.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、宿主細胞へ高効率なベクター導入および高い発現レベルを可能にします。AAVベクターは高い安全性とパッケージング時にすべてのカプシドタンパク質の血清型を選択できるため非常に高い導入効率を実現しています。

厳密な遺伝子発現の活性化：rtTAのみを利用した従来のTet-Onシステムは誘導条件でなくても無視できないレベルの発現漏れが存在します。非誘導条件での発現漏れを最小限にし、幅広いテトラサイクリン濃度に高感度で応答できる当社のTet-On遺伝子発現システムはテトラサイクリンによって遺伝子発現を厳密にon/offできます。

高レベル発現：誘導条件でTREプロモーターは目的遺伝子を非常に高いレベルで発現できます。

安全性:  AAVは複製不能であり、ヒトの疾患の原因とならないので、最も安全なウイルスベクターシステムです。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い: 宿主細胞への導入後、AAVベクターはエピソームDNAとして細胞核に存在します。宿主ゲノムへの挿入が起こらないので癌化の原因となりうる宿主ゲノムの損傷リスクを減らすことができ、ヒトへのin vivo用途に適しています。

高ウイルスタイター：当社のAAVベクターは高いタイターのウイルスを作製できます。当社のウイルス作製サービスを利用すれば1013 GC/ml(genome copy per ml)以上が可能です。

幅広い親和性：適切な血清型でウイルスを作製することによってヒト、マウス、ラットなど一般的に使用される哺乳類動物由来の幅広い細胞及び組織タイプに遺伝子を導入できます。ただし、血清型によっては遺伝子導入が難しい細胞タイプがあります。

In vitroとin vivoで有効：AAVベクターは培養細胞と生体の両方に対して効果的です。

組み込み可能なDNAサイズが限定的：AAVベクターの組み込み可能サイズ上限は他のシステムと比べて最小となります。当ベクターのITRのあいだにクローニングできるサイズは4.7kbが上限となります。ウイルスのパッケージングと感染、そしてテトラサイクリン誘導型遺伝子発現に必要な配列として2.1kbが占められるので、残り約2.6kbを任意の目的で利用できます。

特定の細胞タイプへの遺伝子導入が困難：AVVベクターは適切な血清型を選択することで非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能になります。それぞれの血清型は異なる組織親和性がありますが、どの血清型を使っても遺伝子導入が難しい細胞タイプも存在します。

技術的な複雑さ：AVVベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

TRE promoter: テトラサイクリン応答性プロモーター。その活性化はテトラサイクリンもしくはそのアナログ（ドキシサイクリンなど）に依存し、転写因子群(tTA、rtTA、tTS)による制御を受ける。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 発現させたい目的遺伝子。

SV40 late pA: SV40（Simian virus 40）のlateポリアデニレーションシグナル。目的遺伝子の転写を停止する。

CBh promoter: CMV earlyエンハンサーが付加されたチキン β‐アクチンプロモーター。下流のtTS/rtTAタンパク質を発現する。

tTS: テトラサイクリン応答性転写抑制因子。テトラサイクリン及びそのアナログ（ドキシサイクリンなど）非存在下でTREプロモーターに結合し、遺伝子転写を抑制する。

T2A: Thosea asignaウイルス由来の自己切断2Aペプチドは複数遺伝子を含んだポリシストロニックな翻訳産物を切断して複数のタンパク質を生成する。自己切断は”リボソームスキップ”機構によって起こる。

rtTA: 逆テトラサイクリン応答性転写活性化因子M2 (第二世代)。テトラサイクリンとそのアナログ（ドキシサイクリンなど）に応答してTREプロモーターに結合、遺伝子転写を活性化させる。前世代よりもテトラサイクリン非存在下での発現漏れが低く、低濃度での誘導が可能になった。

BGH pA:ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。tTS/rtTAカセットの転写を停止する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。