Vector Systems
AAV non-coding RNA発現ベクター
概要
AAV non-coding RNA発現ベクターはin vivo、in vitro環境でnon-coding RNAを効果的に発現させることが可能です。Non-coding RNAは多種のshort（30塩基以下）もしくはlong（200塩基以上）機能性RNA分子を含みます。micro RNAs (miRNAs)、small interfering RNAs (siRNAs)、piwi-interacting RNAs (piRNAs)、small nuclear RNAs (snRNAs)、small nucleolar RNAs (snoRNAs)、large intergenic non-coding RNAs (lincRNAs)、intronic long non-coding RNAs (intronic lncRNAs)、natural antisense transcripts (NATs)、enhancer RNAs (eRNAs) 、 promoter-associated RNAs (PARs)などの機能性RNAがあります。これらはタンパク質に翻訳されることはありませんが、DNA複製、エピジェネティック制御、転写および転写後制御そして翻訳制御など数多くの細胞内機構で重要な役割を担っています。
AAV non-coding RNA発現ベクターはRNAポリメラーゼⅡプロモーターを使用してnon-coding RNAを発現するように設計されているので、組織特異的、誘導性もしくは様々な活性強度を持つプロモーターを使用した多様な実験用途に対応できます。RNAポリメラーゼⅡプロモーターによる転写反応はプロモーターの3‘域から始まり、ポリAシグナル配列内で終了します。そのため、当ベクターから生産されるnon-coding RNAとオリジナルのnon-coding RNAの配列は正確に一致せず、上流と下流にいくつかの配列が追加されます。
AAV non-coding RNA発現ベクターはE.coli用プラスミドとして作製されます。non-coding RNAと上流のプロモーターは2つのITR（inverted terminal repeats）のあいだにクローニングされます。AAV non-coding RNA発現ベクターはヘルパープラスミドとともにパッケージング細胞に導入され、ITRのあいだのnon-coding RNA を含むDNA領域がウイルスにパッケージングされます。ウイルスの感染によってnon-coding RNAはウイルスゲノムとともに標的細胞に導入されます。
AAV野生株のゲノムはssAAVと呼ばれる、線状の一本鎖DNA（ssDNA）であり、両端にヘアピン構造を持つITRを持ちます。ssAAV上の遺伝子が発現するためにはまず、2つの経路によって二本鎖DNAに変換される必要があります。１）DNAポリメラーゼがssDNAゲノムをテンプレート、3' ITRを複製開始サイトとして相補鎖を複製する。２）ssAAVゲノムのあいだで＋鎖と－鎖のあいだの分子間ハイブリダイゼーションによって2本鎖DNAを作り出す。二本鎖DNAへの変換は主に１）の経路によってなされます
AAVゲノムDNAは宿主細胞の核内で連結した（コンカテマー）エピソームDNAとして維持されます。エピソームDNAは宿主ゲノム内で複製されないので、AAVゲノムは非増殖細胞では宿主細胞内で維持されますが、増殖細胞では細胞分裂によって希釈されて最終的には消失します。AAVゲノムが宿主ゲノムに挿入されることは非常に稀です。それゆえベクターの挿入によって細胞が癌化する懸念がないのでAAVベクターは遺伝子治療などの用途に適しています。
AVVは複製不能でヒトに対して炎症反応などの疾患の原因にほとんどならないために、バイオセーフティレベル1の施設で扱うことができ、非常に実用性が高いシステムです。AAVは宿主生体内での免疫原性が低く、様々な動物実験に理想的なウイルスベクターです。
自然界から単離された複数のAAV株は、ウイルス表面のカプシドタンパク質の抗原性に基づいた血清型で分類できます。血清型によってウイルスの親和性（感染の組織特異性）が変わります。AAVベクターをパッケージングする際には異なるカプシドタンパク質を選択することでウイルスの血清型を変更することができます。AAVの血清型と組織親和性の対応については下記の表をご覧ください。
セロタイプ別
組織別
| Serotype | Tissue tropism |
|---|---|
| AAV1 | 平滑筋, 骨格筋, 中枢神経系, 脳, 肺, 網膜, 内耳, 膵臓, 心臓, 肝臓 |
| AAV2 | 平滑筋, 中枢神経系, 脳, 肝臓, 膵臓, 腎臓, 網膜, 内耳, 精巣 |
| AAV3 | 平滑筋, 肝臓, 肺 |
| AAV4 | 中枢神経系, 網膜, 肺, 腎臓, 心臓 |
| AAV5 | 平滑筋, 中枢神経系, 脳, 肺, 網膜, 心臓 |
| AAV6 | 平滑筋, 心臓, 肺, 膵臓, 脂肪, 肝臓 |
| AAV6.2 | 肺, 肝臓, 内耳 |
| AAV7 | 平滑筋, 網膜, 中枢神経系, 脳, 肝臓 |
| AAV8 | 平滑筋, 中枢神経系, 脳, 網膜, 内耳, 肝臓, 膵臓, 心臓, 腎臓, 脂肪 |
| AAV9 | 平滑筋, 骨格筋, 肺, 肝臓, 心臓, 膵臓, 中枢神経系, 網膜, 内耳, 精巣, 肝臓, 脂肪 |
| AAVrh10 | 平滑筋, 肺, 肝臓, 心臓, 膵臓, 中枢神経系, 網膜, 腎臓 |
| AAV-DJ | 肝臓, 心臓, 腎臓, 脾臓 |
| AAV-DJ/8 | 肝臓, 脳, 腎臓, 脾臓 |
| AAV-PHP.eB | 中枢神経系 |
| AAV-PHP.S | 末梢神経系 |
| AAV2-retro | 脊髄神経 |
| AAV2-QuadYF | 内皮細胞, 網膜 |
| AAV2.7m8 | 網膜, 内耳 |
| Tissue type | Recommended AAV serotypes |
|---|---|
| 平滑筋 | AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
| 骨格筋 | AAV1, AAV9 |
| 中枢神経系 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB |
| 末梢神経系 | AAV-PHP.S |
| 脳 | AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8 |
| 網膜 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8 |
| 内耳 | AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8 |
| 肺 | AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10 |
| 肝臓 | AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 膵臓 | AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
| 心臓 | AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ |
| 腎臓 | AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 脂肪 | AAV6, AAV8, AAV9 |
| 精巣 | AAV2, AAV9 |
| 脾臓 | AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 脊椎神経 | AAV2-retro |
| 内皮細胞 | AAV2-QuadYF |
当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください
| References | Topic |
|---|---|
| Cell. 157:77 (2014) | Review on non-coding RNAs |
| Front Genet. 6:2 (2015) | Review on functionality of non-coding RNAs |
| RNA. 18:111 (2012) | AAV-mediated in vivo delivery of long non-coding RNA |
| Methods in Enzy. 507:229-54 (2012) | Review of AAV virology and uses |
| Curr Opin Pharmacol. 24:59-67 (2015) | AAV use in gene therapy, and serotype differences |
特長
AAV non-coding RNA発現ベクターはE.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、宿主細胞へ高効率なベクター導入および高い発現レベルを可能にします。AAVベクターは高い安全性とパッケージング時にすべてのカプシドタンパク質の血清型を選択できるため、非常に高効率なnon-coding RNA発現カセット導入を実現しています。
メリット
安全性: AAVは複製不能であり、ヒトの疾患の原因とならないので、最も安全なウイルスベクターシステムです。
宿主ゲノムの損傷リスクが低い: 宿主細胞への導入後、AAVベクターはエピソームDNAとして細胞核に存在します。宿主ゲノムへの挿入が起こらないので癌化の原因となりうる宿主ゲノムの損傷リスクを減らすことができ、ヒトへのin vivo用途に適しています。
高ウイルスタイター：当社のAAVベクターは高いタイターのウイルスを作製できます。当社のウイルス作製サービスを利用すれば1013 GC/ml(genome copy per ml)以上が可能です。
幅広い親和性：適切な血清型でウイルスを作製することによってヒト、マウス、ラットなど一般的に使用される哺乳類動物由来の幅広い細胞及び組織タイプに遺伝子を導入できます。ただし、血清型によっては遺伝子導入が難しい細胞タイプがあります。
In vitroとin vivoで有効：培養細胞と生体内の細胞に対しても使用できます。
デメリット
組み込み可能なDNAサイズが限定的：AAVベクターの組み込み可能サイズ上限は他のシステムと比べて最小となります。ITRのあいだの4.7kbのDNA配列が上限となり、4.2kbを実験用途に使用できます。
特定の細胞タイプへの遺伝子導入が困難：AVVベクターは適切な血清型を選択することで非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能になります。それぞれの血清型は異なる組織親和性がありますが、どの血清型を使っても遺伝子導入が難しい細胞タイプも存在します。
技術的な複雑さ：AVVベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。
基本コンポーネント
5' ITR: 5' inverted terminal repeat。野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。
Promoter: non-coding RNAを発現するプロモーター。
Non-coding RNA: 実験に使用するnon-coding RNA。
Regulatory element：WPRE（Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）を追加できる。WPREはパッケージング細胞内でウイルスを安定化してウイルスタイターを増加させ、遺伝子発現を高める。
BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。non-coding RNAの転写を停止する。
3' ITR: 3' inverted terminal repeat。
Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。
pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。