一本鎖アデノ随伴ウイルス（ssAAV）Tet調節タンパク質発現ベクター

ベクタービルダー社の一本鎖アデノ随伴ウイルス（ssAAV）Tet調節タンパク質発現ベクターはAAVを利用した哺乳類動物細胞へのTet調節タンパク質（tTS、rtTAなど）の導入を可能にし、テトラサイクリンによるテトラサイクリン応答性（TRE）プロモーター下流の目的遺伝子の発現誘導を可能にします。

Tet-On誘導性遺伝子発現システムは哺乳類細胞における目的遺伝子の発現タイミングを制御できる強力なツールです。当社のTet誘導性遺伝子発現ベクターはテトラサイクリン（もしくはドキシサイクリンなどのアナログ）非存在条件下でのほぼ完全な遺伝子発現抑制と、テトラサイクリンの添加に応じた目的遺伝子の強力かつ素早い発現誘導を実現します。当システムはテトラサイクリン非存在下のtTSタンパク質による能動的な発現抑制効果とテトラサイクリン存在下のrtTAタンパク質による強力な発現誘導効果が組み合わされています。TetR（Tet抑制タンパク質）とKRAB-AB（Kid1タンパク質の転写抑制ドメイン）の融合タンパク質であるtTSはテトラサイクリン非存在条件でTRE（tetracycline-responsive element）プロモーターに結合して遺伝子の転写を抑制します。一方で、Tet抑制タンパク質の変異体とVP16（単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質の転写活性化ドメイン）との融合タンパク質であるrtTAはテトラサイクリン存在条件でTREプロモーターに結合して遺伝子の転写を活性化します。

ssAAV Tet調節タンパク質発現ベクターはE.coli用プラスミドとして作製されます。任意のプロモーターとTet調節タンパク質から構成される発現カセットはITR (inverted terminal repeat)のあいだにクローニングされます。ssAAV Tet調節タンパク質発現ベクターとヘルパープラスミドがパッケージング細胞に同時導入されるとITRのあいだのDNA領域はウイルスにパッケージングされます。ITRのあいだに配置されたすべての遺伝子はウイルスゲノムとともに標的細胞へと導入されます。

当社のssAAV Tet調節タンパク質発現ベクターは任意のプロモーターを使用したTet調節タンパク質発現カセットが組み込まれています。しかし、テトラサイクリン非存在条件での発現漏れを最小限に抑え、テトラサイクリン存在条件で発現誘導をするためには独立したヘルパーベクターからTREプロモーターによって発現される目的遺伝子が供給される必要があります。

AAVは多くの哺乳類細胞タイプへの遺伝子導入に効果的であることに加えて、アデノウイルスと異なり免疫原性が非常に低く、ほとんど病原性がありません。そのためAAV誘導型遺伝子発現ベクターはin vivo環境で遺伝子発現を誘導する用途に適しています。

AAV野生株のゲノムはssAAVと呼ばれる線状の一本鎖DNA（ssDNA）であり、両端にヘアピン構造を持つITRを持ちます。ssAAV上の遺伝子が発現するためにはまず、2つの経路によって二本鎖DNA(dsDNA) に変換される必要があります。１）DNAポリメラーゼがssDNAゲノムをテンプレート、3' ITRを複製開始サイトとして相補鎖を複製する。２）ssAAVゲノムのあいだで＋鎖と－鎖のあいだの分子間ハイブリダイゼーションによって2本鎖DNAを作り出す。二本鎖DNAへの変換は主に１）の経路によってなされます

AAVゲノムDNAは宿主細胞の核内で連結した（コンカテマー）エピソームDNAとして維持されます。エピソームDNAは宿主ゲノム内で複製されないので、AAVゲノムは非増殖細胞では宿主細胞内で維持されますが、増殖細胞では細胞分裂によって希釈されて最終的には消失します。AAVゲノムが宿主ゲノムに挿入されることは非常に稀です。それゆえベクターの挿入によって細胞が癌化する懸念がないのでAAVベクターは遺伝子治療などの用途に適しています。

AVVは複製不能でヒトに対して炎症反応などの疾患の原因にほとんどならないために、バイオセーフティレベル1の施設で扱うことができ、非常に実用性が高いシステムです。AAVは宿主生体内での免疫原性が低く、様々な動物実験に理想的なウイルスベクターです。

自然界から単離された複数のAAV株は、ウイルス表面のカプシドタンパク質の抗原性に基づいた血清型で分類できます。血清型によってウイルスの親和性（感染の組織特異性）が変わります。AAVベクターをパッケージングする際には異なるカプシドタンパク質を選択することでウイルスの血清型を変更することができます。クローニングの際、特異性に影響を与えないためにこの分野では一般的であるAAV2由来のITRが使用されています。パッケージング用のヘルパープラスミドにはRep/Capプラスミドがあり、AAV2由来の複製遺伝子と選択した血清型のカプシドタンパク質を含み、指向性を決定します。AAVの血清型と組織親和性の対応については下記の表をご覧ください。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください。

当社のssAAV Tet調節タンパク質発現ベクターはAAVによって哺乳類動物細胞にTet調節タンパク質を高効率に導入できます。当ベクターによるtTSおよびrtTAとTREプロモーターによって発現される目的遺伝子を共発現させることでテトラサイクリン非存在条件下の目的遺伝子のほぼ完全な発現抑制と、テトラサイクリン添加に応じた強力かつ素早い発現誘導を可能にします。ssAAV Tet調節タンパク質発現ベクターはE.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、宿主細胞へ高効率なベクター導入および高い発現レベルを可能にします。AAVベクターは高い安全性とパッケージング時にすべてのカプシドタンパク質の血清型を選択できるため非常に高い導入効率を実現しています。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い: 宿主細胞への導入後、AAVベクターはエピソームDNAとして細胞核に存在します。宿主ゲノムへの挿入が起こらないので癌化の原因となりうる宿主ゲノムの損傷リスクを減らすことができ、ヒトへのin vivo用途に適しています。

高ウイルスタイター：当社のAAVベクターは高いタイターのウイルスを作製できます。当社のウイルス作製サービスを利用すれば10¹³ GC/ml(genome copy per ml)以上が可能です。

幅広い親和性：適切な血清型でウイルスを作製することによってヒト、マウス、ラットなど一般的に使用される哺乳類動物由来の幅広い細胞及び組織タイプに遺伝子を導入できます。ただし、血清型によっては遺伝子導入が難しい細胞タイプがあります。

In vitroとin vivoで有効：AAVベクターは培養細胞と生体の両方に対して効果的です。

組み込み可能なDNAサイズが限定的：AAVベクターのITRのあいだにクローニングできる組み込み可能サイズ上限4.7kbであり、他のウイルスシステムと比べて最小となります。4.2kbを上限して任意の実験用途に使用できます。

特定の細胞タイプへの遺伝子導入が困難：AVVベクターは適切な血清型を選択することで非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能になります。それぞれの血清型は異なる組織親和性がありますが、どの血清型を使っても遺伝子導入が難しい細胞タイプも存在します。

技術的な複雑さ：AVVベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

Promoter: Tet調節タンパク質を発現させる任意のプロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: Tet調節タンパク質の遺伝子。

Re：WPRE（Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）を追加できる。WPREはパッケージング細胞内のウイルスの安定性を高めてウイルスタイターを増加させる。また、目的遺伝子の転写停止にも寄与して発現レベルを上昇させる。

BGH pA:ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。Tet調節タンパク質の転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。