AAV Cas9発現ベクター

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます（同様にZFNやTALENなどもよく利用されます）。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA（gRNA）と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

CRISPRによる遺伝子ターゲティングには細胞内で標的配列特異的なgRNAとCas9が共発現している必要があります。Cas9とgRNAをひとつのベクター(all-in-oneベクター)から発現させるか、Cas9とgRNAをそれぞれ独立したベクターから発現させることによって共発現が可能になります。Cas9とgRNAの発現に独立したベクターを使うメリットは、実験目的に応じて様々なgRNAとCas9（野生株Cas9、ニッケース、不活性型Cas9など）を柔軟に組み合わせて使用できる点です。

当社はCas9コレクションとして複数のSpCas9（Streptococcus pyogenes由来のCas9）バリアントを用意しており、当社のオンラインポータルを利用して任意のCas9発現ベクターを容易に設計できます。Cas9バリアントとして、１）ヒトコドン使用頻度に最適化され、効率的なDSB（double-strand breaks）生成が可能なhCas9、２）DNAの一本鎖切断（ニック）のみを生成するhCas9ニッケース変異体hCas9-D10A、３）D10AとH840A変異を持つ不活性型hCas9であるdCas9、４）オフターゲット活性を減少させ、特異性を高めたSpCas9-HF1とeSpCas9を用意しています。加えて、dCas9と転写活性化ドメインの融合タンパク質であるdCas9/VP64、dCas9/VPR（CRISPRa用途）や転写抑制ドメインの融合タンパク質dCas9/KRAB（CRISPRi用途）も利用できます。その他にも、遺伝子サイズの小さいCas9バリアントが必要ならばStaphylococcus aureus由来のSaCas9や、DSB後に突出末端を生成するAcidaminococcus 由来のAsCpf1が用意されています。

AAV Cas9発現ベクターはE.coliのプラスミドとして作製されています。AAV Cas9発現ベクターがヘルパープラスミドと共にパッケージング細胞に導入されると、ITRのあいだのDNA領域がウイルスとしてパッケージングされます。ウイルスが標的細胞に感染するとCas9発現カセットはウイルスゲノムと一緒に細胞内に導入されます。

AAV野生株のゲノムはssAAVと呼ばれる、線状の一本鎖DNA（ssDNA）であり、両端にヘアピン構造を持つITRを持ちます。ssAAV上の遺伝子が発現するためにはまず、2つの経路によって二本鎖DNAに変換される必要があります。１）DNAポリメラーゼがssDNAゲノムをテンプレート、3' ITRを複製開始サイトとして相補鎖を複製する。２）ssAAVゲノムのあいだで＋鎖と－鎖のあいだの分子間ハイブリダイゼーションによって2本鎖DNAを作り出す。二本鎖DNAへの変換は主に１）の経路によってなされます

AAVゲノムDNAは宿主細胞の核内で連結した（コンカテマー）エピソームDNAとして維持されます。エピソームDNAは宿主ゲノム内で複製されないので、AAVゲノムは非増殖細胞では宿主細胞内で維持されますが、増殖細胞では細胞分裂によって希釈されて最終的には消失します。AAVゲノムが宿主ゲノムに挿入されることは非常に稀です。それゆえベクターの挿入によって細胞が癌化する懸念がないのでAAV Cas9発現ベクターは遺伝子治療などの用途に適しています。

AVVは複製不能でヒトに対して炎症反応などの疾患の原因にほとんどならないために、バイオセーフティレベル1の施設で扱うことができ、非常に実用性が高いシステムです。さらに、その抗原性の低さから当社のAAV Cas9発現ベクターはin vivoでCRISPRを使用する用途に最適です。

自然界から単離された複数のAAV株は、ウイルス表面のカプシドタンパク質の抗原性に基づいた血清型で分類できます。血清型によってウイルスの親和性（感染の組織特異性）が変わります。AAVベクターをパッケージングする際には異なるカプシドタンパク質を選択することでウイルスの血清型を変更することができます。当社が提供する血清型は1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.2, 7, 8, 9, rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro and AAV2-QuadYFとなります。クローニングの際、特異性に影響を与えないためにこの分野では一般的であるAAV2由来のITRが使用されています。パッケージング用のヘルパープラスミドにはRep/Capプラスミドがあり、AAV2由来の複製遺伝子と選択した血清型のカプシドタンパク質を含み、指向性を決定します。AAVの血清型と組織親和性の対応については下記の表をご覧ください。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

当社のAAVベクターシステムはE.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範囲な細胞タイプへの高効率な導入および導入遺伝子の高い発現量を実現します。AAVベクターは高い安全性とパッケージング時にすべてのカプシドタンパク質の血清型を選択できるため、非常に高効率な遺伝子導入を実現できます。

柔軟性：AAV Cas9発現ベクターは複数のgRNA発現ベクターと使用することで、複数のゲノムサイトを同時に標的にできます。

安全性:  AAVは複製不能であり、ヒトの疾患の原因とならないので、最も安全なウイルスベクターシステムです。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い: 宿主細胞への導入後、AAVベクターはエピソームDNAとして細胞核に存在します。宿主ゲノムへの挿入が起こらないので癌化の原因となりうる宿主ゲノムの損傷リスクを減らすことができ、ヒトへのin vivo用途に適しています。

高ウイルスタイター：当社のAAVベクターは高いタイターのウイルスを作製できます。当社のウイルス作製サービスを利用すれば10¹³ GC/ml(genome copy per ml)以上が可能です。

幅広い親和性：適切な血清型でウイルスを作製することによってヒト、マウス、ラットなど一般的に使用される哺乳類動物由来の幅広い細胞及び組織タイプに遺伝子を導入できます。ただし、血清型によっては遺伝子導入が難しい細胞タイプがあります。

In vitroとin vivoで有効：培養細胞と生体内の細胞に対しても使用できます。

特定の細胞タイプへの遺伝子導入が困難：AVVベクターは適切な血清型を選択することで非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能になります。それぞれの血清型は異なる組織親和性がありますが、どの血清型を使っても遺伝子導入が難しい細胞タイプも存在します。

技術的な複雑さ：AVVベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

PAMが必要：CRISPR/Cas9システムはgRNA標的配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。必要なPAM配列は使用するCas9バリアントに依存します。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

Promoter: Cas9バリアントを発現するプロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: Cas9バリアントの遺伝子。

Regulatory element: WPRE（Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）を追加できる。WPREはパッケージング細胞内でウイルスを安定化してウイルスタイターを増加させ、遺伝子発現を高める。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。