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アデノ随伴ウイルス(AAV)遺伝子ターゲティングドナーベクター

概要

CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9)ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます(同様にZFNやTALENなどもよく利用されます)。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA(gRNA)と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

Cas9による標的DNA配列の切断はDSB(二本鎖切断)を作り出します。それに続いて2種類のDNA修復機構(非相同末端結合(non-homologous end joining、NHEJ)、相同組み換え修復(homology directed repair、HDR))のどちらかによって切断箇所の修復が行われます。細胞内でのDSBの修復は、主にNHEJによってなされ、小規模な配列の欠損(稀に挿入および塩基置換)を引き起こします。これらの変異が遺伝子のタンパク質翻訳領域で発生すると(欠損、挿入が原因となるフレームシフトによって)、遺伝子機能の破壊につながります。効率は低くなりますが、CRISPR/Cas9ベクターと外来性ドナーDNAテンプレートを同時に導入することによってHDRによるDSBの修復も可能です。HDRによって標的となるゲノムDNA配列はDNAテンプレート配列に組み換えられるため、点変異などを導入可能です。

ベクタービルダーの遺伝子ターゲティングドナーベクターは、標的ゲノム配列にレポーター、蛍光タグ、その他の任意の配列を効率的に挿入することが可能です。ドナーベクターは任意の標的ゲノム配列の上流と下流に相同配列を組み込めるように設計されています。効果的にHDRによる配列挿入を行うためには、挿入予定配列の近傍(相同配列から10‐15bp以内にあることが理想)にDSBを作り出すことが必要です。さらに、遺伝子ターゲティングドナーベクターを設計する場合には、Cas9がHDR後のゲノムを再切断してしまう可能性を排除するためにPAM配列を取り除く、もしくは改変することをお勧めします。

AAV遺伝子ターゲティングドナーベクターは、大腸菌用のプラスミドDNAとして構築されます。続いてヘルパープラスミドと共にパッケージング細胞にトランスフェクションされ、5'側inverted terminal repeat (ITR)と3’側ITRに挟まれた配列が生ウイルス粒子内にパッケージングされます。ITRのあいだのドナー配列とホモロジーアームは、ウイルスゲノムの残りの部分とともに標的細胞に導入されます。別のベクターから発現されるCas9とgRNAによって標的配列でのDSBが生み出され、ドナー配列が挿入されます。

AAV野生型ゲノムは一本鎖状のDNA(ssDNA)で、両端にヘアピン構造を形成する2つのITRを持つために、ssAAVとも呼ばれます。ssAAV上の遺伝子が発現するためにはまず、2つの経路によって二本鎖DNAに変換される必要があります。1)DNAポリメラーゼがssDNAゲノムをテンプレート、3' ITRを複製開始サイトとして相補鎖を複製する。2)ssAAVゲノムのあいだで+鎖と-鎖のあいだの分子間ハイブリダイゼーションによって2本鎖DNAを作り出す。二本鎖DNAへの変換は主に1)の経路によってなされます AAVは宿主細胞内で複製できないこと、炎症を引き起こすことがほぼないこと、さらにヒトにおいて疾患の原因とならないことから、バイオセーフティレベル1(BSL1)の実験室で扱えるという大きな利点があります。宿主細胞での免疫原性が低いために、ベクタービルダーのAAV CRISPRベクターはin vivo CRISPRアプリケーションへの理想的なツールとなります。

AAVは多くの系統が同定されており、ウイルスの表面タンパク質(カプシドタンパク質)の抗原性の違い(血清型またはセロタイプ)により型が分類されています。セロタイプの違いにより、組織指向性(組織別感染効率)が異なります。AAVベクターをウイルス粒子にパッケージングする際は、組織指向性を考慮して使用するウイルスのセロタイプを選ぶ必要があります。ベクタービルダーのAAVベクターシステムで現在提供されているセロタイプには、1、2、3、4、5、6、6.2、7、8、9、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retroおよびAAV2-QuadYFがあります。AAVベクターにはこの分野では一般的な、特異性に影響を与えないAAV2由来のITRが組み込まれています。パッケージング用のヘルパープラスミドにはRep/Capプラスミドがあり、AAV2由来の複製遺伝子と選択した指向性を持つセロタイプのカプシドタンパク質を含みます。以下の表はAAVセロタイプと指向性を持つ標的組織・細胞のリストです。 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください。

References Topic
Science. 339:819 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Biotechniques. 59:201 (2015) CRISPR/HDR-mediated knockin of large DNA fragments
Front Genet. 9:691 (2019) Methodologies for improving HDR efficiency
Mol Ther Nucleic Acids. 1:14 (2019) Increased HDR efficiency with viral vector delivery

特長

当社の遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターはCRISPRターゲッティングによって標的ゲノムサイトに作られたDSBを利用してHDRによる任意の配列(レポーター、蛍光タグまたはその他のDNA配列など)を挿入できるように設計されています。遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターはCRISPRによる標的ゲノムサイトのDSBとドナー配列の上流と下流に配置された相同組み換え配列を利用して、効率的なドナー配列の挿入を行います。AAVトランスファーベクター上にドナー配列と相同組み換え配列を搭載することで、高タイターのパッケージングと適切なセロタイプの使用による標的細胞への高効率トランスダクションを実現しています。

メリット

正確な改変:遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターとしてドナーテンプレートを導入することで標的ゲノム配列にHDRによる正確な配列改変をおこなえます。

高ウイルスタイター:ベクタービルダーのAAVベクターは高タイターのウイルスを作製できます。当社のウイルス作製サービスを利用すれば1013 GC/ml (genome copy per ml)以上が可能です。

幅広い指向性:適切なセロタイプでウイルスを作製することによってヒト、マウス、ラットなど一般的に使用される哺乳類動物由来の幅広い細胞及び組織タイプに遺伝子を導入できます。ただし、セロタイプによっては遺伝子導入が難しい細胞タイプがあります。

デメリット

搭載ゲノムサイズが小さい: AAVはベクタービルダーのウイルスベクターの中で、搭載できるウイルスゲノムサイズが最小です。AAVが許容できるITR間の最大サイズは4.7kbのため、ユーザーが選択できる遺伝子やコンポーネントの合計サイズは~4.2 kbに制限されます。

特定の細胞タイプへの形質転換が困難:AVVベクターは適切なセロタイプを選択することで非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能になります。しかし、それぞれのセロタイプは異なる組織指向性があり、どの血清型を使っても遺伝子導入が難しい細胞タイプも存在します。

効率の低さ:Cas9による標的配列切断後の修復はNHEJが主であり、HDRによる修復頻度は非常に低くなります。そのため、外来性ドナーDNAテンプレートをもちいたCRISPR/Cas9ターゲティングをおこなうと、NHEJ修復された細胞とHDR修復された細胞が混在している細胞集団が生じます。得られた細胞集団からHDRによる望みのゲノム編集を受けた細胞を慎重にスクリーニング、同定することが重要です。相同遺伝子座の両方に同様の遺伝子改変が必要な場合は、同じノックイン手順が必要になるケースもあります。

PAMが必要:CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。Cas9がHDRによって編集された後、ドナーテンプレートや編集されたゲノム遺伝子座を破壊されることを防ぐために、ドナーベクターにPAM配列が存在する場合には、それを除外するか改変することが重要です。

ベクタービルダーの発現ベクター基本コンポーネント

5' ITR: 5’ inverted terminal repeat. 野生型ウイルスでは5’ITRと3’ITRは同じ配列で、ウイルスゲノム両端に反対の方向で配置されており、ウイルスゲノムの複製起点になります。

5' -Homology Arm:  挿入配列のすぐ上流の相同配列。配列の長さは挿入配列の長さに依存する。長い挿入配列ほど長い相同配列が必要。

Donor Sequence/Cassette: 標的ゲノムサイトにノックインする挿入配列。

3' -Homology Arm: 挿入配列のすぐ下流の相同配列。配列の長さは挿入配列の長さに依存する。長い挿入配列ほど長い相同配列が必要。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. 5’UTRの項目を参照下さい。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

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