CRISPR（クリスパー）ゲノム編集ソリューションズ

VectorBuilderは、in vitroとin vivoのゲノム編集研究用に、様々なCRISPRツールの受託サービスを競合的な価格と納期でユーザーにご提供しています。CRISPRゲノム編集ツールは、プラスミド、ウイルス、さらにRNAやRNPなどを、ご希望の実験系にready-to-useで使えるよう、様々な納品フォーマットにカスタム対応しています。カスタムウイルスパッケージングサービスは、レンチウイルス、AAV、アデノウイルスなど、多彩な研究用ウイルスに対応し、トランスフェクション法ではゲノム編集が困難な細胞株に対して、ウイルスを使ったCRISPRシステムで効果的なゲノム編集の実施が可能です。

VectorBuilderはCRISPRシステムを使ったカスタムライブラリーの構築実績も豊富です。ライブラリーはノックアウト、遺伝子活性化、遺伝子抑制化など、目的のスクリーニングが効果的に実施できるよう、ライブラリーデザインのサポートから、ライブラリー構築さらにNGS解析まで全てのサービスを提供しています。またユーザーが必要とする過程のサービスのみの場合にもフレキシブルに対応しています。カスタム構築ライブラリーサービス以外に、VectorBuilder独自技術で構築した、デュアル（二重)-gRNAノックアウトライブラリー(dual-gRNA knockout library）もご検討ください。ヒトまたはマウスのホールゲノムに対して遺伝子の機能的スクリーニングを最もパワフルに実行できるツールです。

VectorBuilderが培ってきたモレキュラークローニング技術、遺伝子導入技術、遺伝子ターゲッティング技術を最大限に生かし、ユーザーが必要なCRISPRゲノム編集ツールをワンストップで全て調達できるラインナップをここに充実させています。

当社受託サービスの特徴 

• VectorBuilderは、ヒト/マウス/ラットなど主要生物の全ゲノムに対するgRNAデータベースを構築している。ベクターデザインは非常にインチュイティブ（直観的に操作できる）なプラットフォームがオンライン上で使え、簡単に素早く目的のCRISPRデザインが行える。ユーザーがデザインしたベクターは、見積もり依頼時に、ベクターデザイン担当者が検証を行い変更などがある場合はアドバイスが見積もりととともに届く。
• 豊富なベクターバックボーンコレクション(例：発現ベクター、レンチウイルス、AAV、アデノウイルス、piggyBac) と、網羅的なベクターコンポーネント (例:プロモーター、Cas9 バリアント、蛍光マーカー、薬剤選択マーカーなど)がオンライン上のベクターデザインポータルに揃っている。
• redy-to-useなど、ユーザーの目的に合わせた納品形態にフレキシブルに対応。例えば、プラスミド納品、ウイルス納品、 Cas9 mRNA + gRNA納品、Cas9-gRNA RNP 複合体納品など。
• 豊富なCRISPRライブラリー構築オプション
• 確かな品質、早い納期、競合的な価格を提示
• 実験デザイン、データ分析、トラブルシューティングのサポート

CRISPRシステムを使ったゲノム編集の概要

CRISPRシステムの従来型では Cas9 タンパク質とガイドRNA (gRNA)の2つのコンポーネントを使います。 最も一般的に使用されるCas9は、化膿レンサ球菌 Streptococcus pyogenes から設計されたSpCas9 またはそれをヒトコドンに最適化したhCas9です。Cas9タンパク質はRNA誘導のDNAヌクレアーゼとしての機能をもち、特異的なターゲットサイトに二本鎖DNAの切断(double-stranded breaks : DSBs) を生じさせます (図1)。Cas9 バリアントもよく研究に用いられ、 “ニッケース” または Cas9(D10A)と呼ばれる機能としてはDNAに一本鎖切断を生じさせるCas９があります。仮にCas9ニッケースを、隣接する2種類のgRNAと組み合わせて使用すると、ニッケースは各相補鎖に一か所ずつ、合計2か所の1本鎖切断を生じさせ結果的にDSBが生じ、細胞は非相同末端結合(nonhomologous end-joining :NHEJ)経路を経て、DNA切断を修復します。これにより、通常小さなランダムな欠失、まれに挿入や塩基置換がおこります。これらの変異がタンパク質をコードする領域を破壊すると（例えば、フレームシフトを引き起こす欠失）機能的な遺伝子ノックアウトを発生させることができます。他の方法としては、CRISPRコンポーネントと同時に外来性ドナーDNAテンプレートを目的細胞に共導入し、相同性修復（ homology-directed repair ：HDR)を伴ったDSB修復を発生させます。この方法では、ターゲットゲノムDNAシークエンスがドナーDNAシークエンスで置換され、あらかじめドナーDNAシークエンスにデザインしていた点突然変異やノックインなどを人為的にターゲットサイトに導入します。ドナーDNAテンプレートは、一本鎖オリゴDNAヌクレオチド (ssODN) または dsDNAフラグメント (通常リニア化されたプラスミドDNA)で、ssODNsは点突然変異の導入またはエピトープタグや制限酵素サイトの人為的挿入に適しています。dsDNAフラグメントは大きな断片のノックインに広く使用されています。 

図1. CRISPRによる DNA修復のメカニズム

デリバリー方法の種類

CRISPR システムを哺乳類細胞にデリバリーする代表的な方法 (図２）:

カスタムデザイン CRISPR ベクター:

ご注意ください: AAVはウイルス内に搭載できるDNAフラグメントのサイズ限界が 4.7 kbであるのに対して、コモンに使われているStreptococcus pyogenes由来のSpCas9のサイズがすでに4.2 kbあります。そのため、プロモーター、gRNA発現カセット、polyAシグナルシークエンスと必要なコンポーネントを組み合わせると、簡単にAAVウイルス搭載限界を超えてしまいます。そのため、VectorBuilderのAAV CRISPRシステムでは、Staphylococcus aureus由来の短いSaCas9 (3.2 kb)をデフォルトバックボーンに採用しています。SaCas9のPAMシークエンスは、NNGRRまたは NNGRRT (デフォルト)で、SpCas9のPAMシークエンス NGGとは異なることをご注意ください。SpCas9を使ったAAV ベクターも構築いたしますので、その場合はお問合せください。

プリメイド（既成品） CRISPRベクター

VectorBuilderではプリメイド（既製品）ベクターのラインナップも充実しています。例として、Cas9 発現ベクター、コントロールgRNAベクター、 CRISPRa や CRISPRiびヘルパーベクターなどです。プリメイドベクターは大腸菌グリセロールストックならは、カルタヘナ法26条1項の情報公開書類をつけて、受注から1-2日で出荷いたします。追加でプラスミドDNA精製、精製RNA、ウイルスパッケージングなどご希望の関連したダウンストリームサービスをショッピングカートに追加することでカスタム納品にフレキシブルに対応しています。

プリメイド（既製品）CRISPRベクター:

AAV パッケージングサービス仕様：

 精製RNA:Cas9 mRNA と gRNA

ユーザーが選択した哺乳類細胞のターゲットサイトに、簡単にRNAベースのCRISPRコンポーネントをデリバリーするツールとして、トランスフェクション-readyそしてマイクロインジェクション-readyのCas9 の受託作製サービスを提供しています。Cas9 mRNAは、野生型ヌクレエーズ (hCas9)そして Cas9 ニッケース (Cas9(D10A))が選択できます。ユーザーが選択したターゲット遺伝子やサイトに、最適化したgRNAをデザインするために、Feng Zhangラボで開発された特異性を高めるためのアルゴリズムに、いままでの研究から経験的に明らかになってきたルールを加えたアルゴリズムを使ってgRNAの最適化の精度を上げています。

CRISPR RNA製品のお見積り表 :

Cas9 タンパク質

精製した野生型Streptococcus pyogenes Cas9タンパク質(SpCas9) とCas9ニッケース(Cas9(D10A))を、Cas9-gRNA RNPを哺乳類細胞デリバリー用にご提供しています。RNPを介したアプローチは、Cas9タンパク質に希望のgRNAを組み込ませて哺乳類細胞にCRISPRコンポーネントをデリバリーします。また、preformed RNPは、ドナーテンプレート（ssODNまたは dsDNA) を同時デリバリーし、ゲノム編集を行うサイトに正確にHDRを介したDNA修復を導入することができます。

 Cas9 タンパク質製品のお見積り表:

ゲノム編集用ドナーDNA

正確なDNAシークエンスをターゲットサイトに入れ換えるために、ドナーDNAテンプレートとしてリニア化したプラスミドをssODNまたはdsDNA のフォーマットでご提供しています。ポイントミューテーションを含むターゲット領域やノックイン用フラグメントなど、目的に合わせて対応いたします。ssODNは短いタグや制限酵素サイトなど、60bp以下のDNAシークエンスの挿入に適しています。 dsDNAは、蛍光マーカーやレポーターなど最長4~5kbのフラグメントで、ターゲットノックインに適しています。

ドナーDNAサービスの価格と作業日数:

CRISPRライブラリー:カスタムまたは既製品

プール型CRISPRライブラリーは、特定のシグナリング経路、疾患、薬物への細胞応答、発生プロセス、遺伝子調節などに関与するコーディング領域またはノンコーディング領域に対して、大規模な機能解析を実施できる強力なツールです。VectorBuilderは、スクリーニング目的に合わせたライブラリーのカスタムデザインをサポートし、プール型ライブラリーを受託構築します。例えば、コーディング領域の機能的スクリーニングとしてのCRISPRノックアウトライブラリー、コーディング領域のgain-of-functionやノンコーディング領域の機能的スクリーニング用にCRISPRa ライブラリー、コーディング領域のloss-of-functionやノンコーディング領域の機能的スクリーニングにCRISPRi ライブラリーなどです。シングルセルベースのスクリーニング用にCRISPRバーコーディングライブラリーの構築も実績があります。CRISPRテクノロジーを使ったカスタムライブラリーを競合的な価格と納期でご提供いたします。

構築するライブラリーは、大腸菌ストック、プラスミドDNAプール、パッケージしたウイルスなど、プロジェクトのアップストリームとダウンストリーム過程に見合った納品形態に対応し、ユーザーのニースにお答えします。VectorBuilderのカスタムライブラリーは、NGSによって完全に検証しています。

• 当社のみが提供できる dual-gRNA レンチウイルスベクターのデザイン
• 全ゲノムを高いカバー率でターゲット
• ライブラリーの品質はNGSで検証済み
• 均一なウイルスを高いターターでご提供
• ready-to-use
• GFP/Puroの二重マーカーで陽性細胞の効率よい単離

既製品（プリメイド）dual-gRNA ライブラリーのご注文詳細:

まとめ：CRISPR ソリューションズ

多用なアプリケーションをもつCRISPRシステムを使うことで、哺乳類細胞へのゲノム編集に実験目的に合うアプローチの選択ができるようになりました。分子生物学の豊富な経験を持つ当社の技術チームは実験の計画からReady-to-useの実験材料の作成まで、CRISPR ゲノム編集プロジェクトにソリューションをご提供します。以下のリストの一般的なCRISPRアプリケーションはもとより、新規で独自のCRISPRアプリケーションにもご対応します。デザインリクエストを送る からお問合せください。

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