CRISPR（クリスパー）ゲノム編集ソリューションズ

目的遺伝子の働きを不活性化し、その影響を調べる目的ではshRNAノックダウンもCRISPRやTALENを使ったノックダウンのどちらも役に立ちます。あなたの目的にとってどちらがより適しているかを判断するためのポイントを以下に記載します。

メカニズム

ノックダウンベクター

ノックダウンベクターはshRNAという短いヘアピン状のRNAによって細胞の標的mRNAを分解、翻訳阻害することで目的遺伝子の機能を抑えます。そのため、shRNAノックダウンベクターは標的遺伝子配列を改変することはありません。

shRNAノックダウンベクターについてはこちらから 

ノックアウトベクター

CRISPRとTALENはどちらもヌクレアーゼにゲノム上の標的配列を切断するように働きかけます。分解された配列が不完全な形で修復され結果、配列の挿入もしくは欠損が起こり、恒久的な変異となります。それらの変異のいくつかは翻訳コドンのずれ（フレームシフト）やストップコドンを作り出し、標的遺伝子の機能不全を引き起こします。ゲノム上で数kb以内にふたつの標的配列が同時に切断された場合は、その間の配列に欠損が起こることもあります。

CRISPRベクターについてはこちらから  

効率

shRNAノックダウンは最も効果的なshRNAをつかったとしても、標的遺伝子の発現を100％抑制することはできません。一方でCRISPRやTALENの場合、一部の細胞で遺伝子の機能を完全に欠損させる変異を持つ細胞を作成できます。

再現性と均一性

一般的にshRNAベクターは、細胞プール内のほとんどの細胞から均一な結果が得られ、複数の実験の間で高い再現性が得られます。一方でCRISPRやTALENは変異が偶発的に引き起こされるので、得られる結果が細胞によって違います。細胞の標的遺伝子を完全に欠損させるためには細胞内のすべての遺伝子コピーを破壊しなくてはなりません。X-またはY-染色体上の遺伝子を除いて大抵の細胞は遺伝子が2コピーあり、そしてがん細胞は2コピー以上の遺伝子を持つので遺伝子を完全に欠損させた細胞が得られる可能性はとても低くなります。このような理由から、CRISPRやTALENのようなヌクレアーゼを利用した遺伝子ノックアウトはすべての標的遺伝子コピーが破壊された細胞をDNAシークエンスによって特定する必要があります。

オフターゲット効果

オフターゲット効果はshRNAノックダウンでもCRISPRやTALENノックアウトでも報告されています。観察された表現型がオフターゲット効果であるかどうかは同じ標的遺伝子に対して異なる複数のshRNAを使うことで確認できます。もし、異なる複数のshRNAノックダウンから得られた表現型が同じならば、その表現型はオフターゲット効果ではない証拠となります。CRISPRやTALENノックアウトを使う場合は、オフターゲット効果による表現型でないことを確認するために標的遺伝子に対して異なる機能欠損変異を持つ複数のクローンを作成して解析する必要があります。加えて、得られた変異体クローンのゲノムから、バイオインフォマティクスによって推測されるオフターゲットとなりうる配列をシークエンスして、それらに変異がないことを確認する方法もあります。

相同性組み換えドナーベクターのデザインはこちらから  

CRISPRとTALENは両方とも培養細胞およびモデル生物のゲノム編集用途に開発されました。どちらも遺伝子のノックアウトや点変異、挿入のノックインに使用できますが、いくつか違いがありそれぞれ長所と短所があります。

メカニズム

CRISPR

CRISPRは部位特異的ガイドRNA(gRNA)を利用して、Cas9ヌクレアーゼにゲノム内の標的部位のDNA配列を切断させます。標的部位は通常およそ20bpの長さであり、数塩基の配列の違いがあっても認識されて切断されてしまうことがあります。

CRISPRベクターについてはこちらから 

TALEN

TALENは、FokIヌクレアーゼドメインに融合したTALエフェクターDNA結合ドメイン(特異的配列を認識する)で構成されるキメラタンパク質を2つで一対のペアとして利用します。タンパク質のペアは、14‐20bp（スペーサー領域）を挟んだ2つの標的部位（∼18bp）に結合するように設計されています。標的部位DNAに結合すると、Foklヌクレアーゼドメインは二量体を形成し、続いてスペーサー領域のDNAを切断します。

効率

CRISPRとTALEN両方とも効率良くゲノム編集できますが、用途、動物種、細胞タイプによって効率は大きく変わります。一般に、CRISPRはTALENよりも効率的に細胞内に導入され、DNAを切断します。

オフターゲット効果

CRISPR gRNAは∼20 bpの配列を標的とし、一方TALENペアは、合計∼36bpの標的配列に結合します。Cas9/gRNA複合体はTALENよりも標的配列とミスマッチがある配列（最大で5bpまで）に結合する可能性があります。したがって、TALENによる切断はCRISPRよりもオフターゲット切断の可能性は低く、高い特異性があります。CRISPRを培養細胞株につかうとオフターゲット効果がみられますが、CRISPRノックアウトマウスの分析からCRISPRを生体につかった場合（in vivo）、オフターゲット効果の頻度は低くなることが報告されています。近年のCRISPRシステムの改良によりCRISPRの特異性は大幅に上昇しました。変異触媒ヌクレアーゼドメイン(例えばCas9_D10AもしくはCas9_H840A)を含むCas9ニッカーゼをデュアルgRNAと一緒に使用することで標的領域の内で2つの一本鎖DNAニックが生成され、ダブルニックDSB(二重鎖破壊)ができます。このデザインでは2つのgRNAを使うことで標的配列が∼40bpに拡張され、オフターゲット効果が起こる可能性を最小限にできます。

標的配列の必要条件

一方、CRISPRはgRNA標的配列の3'末端にPAM配列(通常NGG)が必要となります。遺伝子のノックアウトのみが目的ならばCRISPRを使っても支障はありませんが、遺伝子の特定の部位での切断を必要とする部位特異的突然変異または挿入を導入するときに問題があります。CRISPRを使って特定のゲノム部位に正確な編集をするならば、相同組換えドナーベクターまたは編集標的配列の近傍配列を含むオリゴヌクレオチドをgRNAとCRISPRを共に細胞に導入することで、HDR(相同性組み換え修復)を引き起こして標的部位を正確に編集する方法があります。

相同性組み換えドナーベクターの設計はこちらから 

簡便性

シンプルさでは、CRISPRはいくつかの点でTALENより優れています。第一に、ベクター構築の時に、CRISPRのCas9/gRNA複合体の標的への結合は単純なRNA/DNAハイブリダイゼーションに依存するため、短いgRNAをデザインするだけですが、TALENはタンパク質とDNAの相互作用ごとに特別なTAL DNA結合ドメインの再エンジニアリングを必要とします。そのため、gRNAの設計は、標的配列毎に常に 2つのベクターを必要とするTALENよりも安くて簡単です。しかし、ベクタービルダー社が用意したTALEN認識モジュールはTALENベクターの設計作業を大幅に削減できます。第二に、マウス胚への注入などの一部のアプリケーションにおいてCas9タンパク質およびgRNAの直接注射による効率的な導入が可能ですが、TALENでは同様のことをできません。第三に、CRISPRは、数千の異なるgRNAを発現するCRISPRライブラリーを作成し、ハイスループットでスクリーニングすることが容易であるため、汎用性の高い遺伝子スクリーニングが可能です。

CRISPRを利用したゲノム編集では、Cas9ヌクレアーゼはゲノム上のgRNAの標的配列に誘導され、DNAを切断します。単純な遺伝子破壊株を作成する場合、大抵はシングルgRNAとCas9をつかってDNA二本鎖切断（double-strand break 、DSB）と非相同性末端再結合（non-homologous end joining、NHEJ）を起こして標的配列に小さな挿入/欠損等の変異を導入します。それらの変異のいくつかはフレームシフトや停止コドンを創り出し、遺伝子機能を破壊します。

デュアルgRNAはCas9(D10A)ニッケースと共につかうと標的配列の2本鎖DNAのそれぞれの鎖を標的とします。ニッケースがデュアルgRNAのそれぞれに誘導されてDNA鎖の片方一本ずつを切断し、二本鎖切断を作り出します。この手法では二つのgRNAが二本鎖切断に必要になるのでCRISPR/Cas9によるオフターゲット効果を減らすことができます。

デュアルgRNAはCas9(D10A)ニッケースと外来性ドナーDNAを使うことで、目的遺伝子に任意の塩基置換（ノックインなど）を導入することも可能です。変異を導入したい箇所を挟んだ近接配列の一つずつを標的とする二つのgRNAによって切断箇所の修復に伴った外来性ドナーDNAをつかった相同組み換え修復（homology-directed repair、HDR）が起こります。

デュアルgRNAベクターについてはこちらから