mRNA 遺伝子デリバリーソリューションズ

図 2. mRNA発現を改善するUTR配列の条件検討と最適化。グアシアルシフェラーゼの最大発現量を達成できるmRNAを最適化するために、異なるUTRの組み合わせを検証した。293T細胞をウェル当たり2.3×10⁵個の密度で12ウェルプレートに播種した。1ウェルあたり1ugのmRNAを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後6時間、24時間、48時間、72時間、96時間で、培地20ulを採取し、ガウシアルシフェラーゼ活性を定量した。

HiExpress^TM Gaussia Luciferase IVT mRNAの詳細はこちら

図 3. mRNA発現量はin vitro および in vivoでコドン最適化によって増加する。(A）HEK293T細胞におけるHiExpress™ Firefly Luciferase mRNAおよび他のルシフェラーゼmRNAの発現。12ウェルプレート上で増殖させた細胞に、1ウェルあたり0.5ugのmRNAをトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性をトランスフェクション後6時間、24時間、48時間、72時間で測定した。(B）成体C57BL/6マウスに30ugのLNPカプセル化mRNAを筋肉内注射し、注射後6時間、24時間、48時間にルシフェラーゼ活性を測定した。FLuc WTは野生型ホタルルシフェラーゼを示す。FLuc WT（co）はコドン最適化された野生型ホタルルシフェラーゼを示す。FLuc2はLuc2ホタルルシフェラーゼを示す。

HiExpress^TM Firefly Luciferase IVT mRNAの詳細はこちら 

HiExpress^TM Firefly Luciferase LNP-mRNAの詳細はこちら 

図 4. ポリA サイズの解析. リボヌクレアーゼT1を用いてmRNAからポリAテールを切断し、オリゴdTアフィニティークロマトグラフィーで分離した。抽出されたテールはLC-MSで分析され、一塩基分解能でポリAテールの長さの情報が得られた。(A) Urea-PAGEによるポリAサイズ分析。60ngの消化されたmRNAポリAは120ntと150ntのサイズが予想され、変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析した。(B) LC-MSによるポリAサイズ分析。120pmolのmRNAポリA （予想サイズ120nt） からデコンボリューションしたスペクトル。(C) 予想サイズ120ntのポリＡテールのサイズ分布。棒グラフは、ポリAテールに小さな不均一性があることを示している。エラーバーは3回の消化実験の標準偏差を表す。加重平均長さは123 ntである。

図 5. ゼブラフィッシュ EGFP IVT mRNA 250 pg のマイクロインジェクション後 6 時間の EGFP 発現について、1 細胞期のゼブラフィッシュ胚をスクリーニングした。蛍光画像から、最適化された コザック配列（version 2）によって、in vivo での EGFP 発現が増加することが示された。

Zebrafish EGFP IVT mRNAの詳細はこちら 

図 6. 変性アガロースゲル電気泳動による結果はIVT mRNAは10,000 nt以上であり、非常に高い安定性が保たれていることを示す。

図7. LC-MS-によるキャッピング効率の解析。(A)共転写または(B)酵素的アプローチにより、高効率のキャッピング（99%以上）が達成できる。

図 8. ヌクレオチドの最適化によるmRNA発現の増加とdsRNA不純物の減少。(A）293T細胞におけるホタルルシフェラーゼの発現。修飾ヌクレオチドであるN1-メチルシュードウリジン（m1Ψ）と5-メチルシトシン（m5C）の有無により、種々のmRNAを作成した。12ウェルプレート上で増殖した細胞に、ウェルあたり1ugのmRNAをトランスフェクトした。トランスフェクション後6時間、24時間、48時間における293T細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。エラーバーは標準偏差を示す。(B) ヌクレオチド修飾（m1Ψ）有り、または無しで、磁性ビーズで精製したEGFP IVT mRNAを等量（1ドットあたり750 ng）ブロットし、その後ドットブロットアッセイで検出し、dsRNAの不純物を推定した。

HiExpress^TM Firefly Luciferase IVT mRNAの詳細はこちら 

二本鎖RNA（dsRNA）はIVTの副産物であり、できる限り避けたい高免疫原性の主な原因となる。ドットブロットの結果は、非常に低レベルのdsRNAで超精製スケールを達成するためには、精製工程（例えばIP-PR）の追加が必要であることを示している。 

図 9.  精製工程の違いによるdsRNA除去効率。異なるプロセスで精製した hSpCas9 IVT mRNA を等量（1500 ng/ドット）ずつブロットし、ドットブロットアッセイで検出し、dsRNA の不純物を推定した。HIC, 疎水性相互作用クロマトグラフィー; IP-RP, イオンペア逆相液体クロマトグラフィー

hSpCas9 IVT mRNAの詳細はこちら 

Cryo-TEMの結果は、当社LNP-mRNAの構造的完全性とサイズの均一性を示している。

図 10. LNP-mRNAのクライオ透過電子顕微鏡（cryo-TEM）像。スケールバー=100 nm。

動的光散乱（DLS）分析によると、当社のLNP-mRNA製品は非常に低いPDI値（PDI<0.1）に達していることが示されています。さらに、VectorBuilderはすべてのLNP-mRNA製品について、ゼータ電位が-10 mVから+10 mVの間であることを保証しています。

図  11. 粒子サイズとゼータ電位の分布。PDI(A)とゼータ電位(B)は、粒子の運動により変動する光の強度差を測定するDLSにより決定した。試料のゼータ電位は-1.872 mVから+1.872 mVの間である。

EGFP LNP-mRNAの詳細はこちら