誘導性遺伝子発現ソリューションズ

VectorBuilderは、テトラサイクリン依存的に遺伝子発現を誘導するシステムとして、Tet誘導性遺伝子発現システムの包括的受託サービスを提供します。ユーザーの実験の目的に合わせて、非ウイルス性、ウイルス性、トランスポゾンなどのバックボーンを備え、さまざまなアプリケーションに使える既製品およびカスタムメイドのラインアップです。 トランスフェクションが困難な細胞に対しては、Tetコンポーネントを遺伝子デリバリーするレンチウイルス、AAV、アデノウイルスなどの受託ウイルス作製サービスを様々なタイターとスケールで提供します。さらにテトラサイクリンまたはその類似体(ドキシサイクリンなど)による目的遺伝子(GOI)の効率的かつ信頼性の高い誘導のために、Tet誘導により、目的遺伝子を安定発現させる細胞株の受託作製サービスも提供しています。

Tet 誘導性遺伝子発現ベクターの特徴
  • オールインワンベクターまたはデュアルベクターのフォーマットに対応
  •  tTS/rtTA融合カセットを使った真のオン―オフスイッチ。ロバストなインダクションとリーキー発現の強力な抑制が可能
  • 非ターゲット細胞にはリーキー発現をミニマムに抑制した、低リークで組織特異的発現ベクターを提供
  • 100% シークエンスマッチの保障、競合的な価格、そして早いベクター構築日数
  • 実験デザイン、データ解析そしてトラブルシューティングに強いサイエンスサポートスタッフ
受託サービスの種類
  • カスタムTetベクター
  • ポピュラーTetベクター
  • Tetベクターのウイルスパッケージング
  • Tet 誘導性遺伝子発現細胞株の樹立
技術的情報
  • テトラサイクリン誘導性遺伝子発現
  • オールインワンベクター対デュアルベクター
  • 組織特異的Tet誘導性遺伝子発現

提供している受託サービス

カスタムTetベクター

VectorBuilderは、テトラサイクリン誘導性遺伝子発現カセットを標的細胞に効率的にデリバリーするカスタムベクター構築サービスを提供します。当社のオンライン上で公開されている非常に直感的に使いこなせるベクターデザインプラットフォームを使用し、カスタムベクターをデザインします。幅広いベクターバックボーン(非ウイルス、ウイルス、またはトランスポゾン)のコレクションとベクターコンポーネント(プロモーター、ORF、蛍光および薬物選択マーカー)を、ほぼ無制限に組み合わせて、目的遺伝子発現をTetで調節する独自のベクターデザインと受託構築サービスの発注が可能です。

カスタムTetベクター構築サービスをショッピングカートに入れると、関連サービスとして、プラスミドDNAの増幅と精製、ウイルスパッケージングサービスの追加注文を行えます。

ヒント 
  • TRE駆動型GOI発現ベクターとTet調節タンパク質発現ベクターはオールインワンTetベクターではありません。 Tetシステムを使った遺伝子発現を達成するには、TREプロモーター駆動型GOI発現プラスミドベクターとTet調節タンパク質を発現させるプラスミドベクターの両方が必要です。
  • 第2世代のTetシステムでは、TREプロモーターが使用され、rtTA、tTS、tTAなどのTet調節タンパク質と相互作用します。
  • デュアルベクターシステムをデザインする場合、TRE駆動型GOI発現ベクターとTet調節タンパク質発現ベクター用に2つの異なるマーカーを選択します。実験システムにすでにマーカー(抗生物質耐性遺伝子を発現している目的の細胞など)が含まれている場合は、Tetベクター上のマーカーとの適合性を確認してください。
カスタムTetベクターを選択してください もっと見る
ベクタービルダーの受託ベクター構築サービスについて
ポピュラーTetベクター

VectorBuilderは、オールインワンベクター形式またはデュアルベクター形式のTetベクターのパネルを提供します。Tetベクター構築サービスをショッピングカートに入れると、関連サービスとして、プラスミドDNAの増幅と精製、ウイルスパッケージングサービスの追加注文を行えます。

ベクターピッカーをつかってポピュラーTetベクターを発注する

アドバイス 
  • TRE駆動型GOI発現ベクターとTet調節タンパク質発現ベクターはオールインワンTetベクターではありません。 Tetシステムを使った遺伝子発現を達成するには、TREプロモーター駆動型GOI発現プラスミドベクターとTet調節タンパク質を発現させるプラスミドベクターの両方が必要です
  • Tet 調節タンパク質発現ベクターを選択して、tTA, tTS そして/または rtTAを発現する安定細胞株を樹立します。

オールインワン(Tet-on)

注:  オールインワン(Tet-on)レンチウイルスベクターに関するご依頼は デザインリクエストを送るからお問い合せください。

TRE駆動型GOI発現

Tet調節タンパク質発現

ベクターピッカーから目的のTetベクターが見つからない場合は、必要なコンポーネントや実験目的を デザインリクエスト から送ってください。当社のデザイン担当者が目的に合ったベクターのデザインを行っいます。

Tetベクターのウイルスパッケージング

VectorBuilderは、トランスフェクションが困難な細胞にTet誘導性遺伝子発現システムをデリバリーする、レンチウイルスアデノ随伴ウイルス(AAV)、およびアデノウイルスの高品質のウイルスパッケージングサービスを受託作製いたします。当社独自の技術と試薬により、タイター、純度、生存率、コンシステンシーの点でウイルスパッケージングプロトコルが大幅に改善しました。当社のベクター構築サービスから引き続きウイルスパッケージングサービスをご注文いただいた場合に最適化されています。

レンチウイルスパッケージングサービスの価格と作業日数 表示する
スケール 推奨使用系 一般的なタイター 最小タイター 容量 価格 (消費税・送料別) 作業日数
パイロット 培養細胞 >4x108 TU/ml >108 TU/ml 250 ul (10x25 ul) 52,000円 8-16 日
中容量 >3x108 TU/ml 1 ml (10x100 ul) 78,000円
大容量 >2x109 TU/ml >109 TU/ml 1 ml (10x100 ul) 130,000円
超純粋中容量 培養細胞 & in vivo >2x109 TU/ml >109 TU/ml 500 ul (10x50 ul) 169,000円
超純粋大容量 1 ml (10x 100 ul) 208,000円

TU = 形質導入ユニットまたは感染ユニット(Transduction units またはinfectious units)

AAVパッケージングサービスの価格と作業日数  表示する
スケール 推奨使用系 一般的なタイター 最小タイター 容量 価格 (消費税・送料別) 作業日数
パイロット 培養細胞 >1012 GC/ml >2x1011 GC/ml 250 ul (10x25 ul) 52,000円 10-18 日
中容量 1 ml (10x100 ul) 78,000円
大容量 >5x1012 GC/ml >2x1012 GC/ml 1 ml (10x100 ul) 130,000円
超純粋パイロット 培養細胞 & in vivo >2x1013 GC/ml >1013 GC/ml 100 ul (4x25 ul) 156,000円 16-26 日
超純粋中容量 500 ul (10x50 ul) 234,000円
超純粋大容量 1 ml (10x100 ul) 364,000円

GC = ゲノムコピー

アデノウイルスパッケージングサービスの価格と作業日数  表示する
スケール 推奨使用系 一般的なタイター 最小タイター 容量 価格 (消費税・送料別) 作業日数
パイロット 培養細胞 >2x1010 IFU/ml >1010 IFU/ml 250 ul (10x25 ul) 52,000円 20-32 日
中容量 1 ml (10x100 ul) 78,000円
大容量 >2x1011 IFU/ml >1011 IFU/ml 1 ml (10x100 ul) 130,000円
超純粋中容量 培養細胞 & in vivo >2x1012 VP/ml >1012 VP/ml 500 ul (10x50 ul) 169,000円 22-36 日
超純粋大容量 1 ml (10x100 ul) 208,000円

IFU = Infectious Units(感染ユニット), VP = Viral Particles (ウイルス粒子)

ウイルスパッケージングサービスの詳細を読む

Tet誘導性遺伝子発現安定細胞株

VectorBuilderは、最小限のバックグラウンド発現とGOIの特異的な高い発現誘導を実現させる、Tet誘導性遺伝子発現安定細胞株をカスタム樹立いたします。さらにtTS / rtTA発現細胞株もカスタム樹立いたします。この細胞では、TRE駆動のGOIを搭載したプラスミド/ウイルスでトランスフェクト/形質導入して、柔軟な実験計画と信頼性の高い遺伝子誘導を実現できます。Tet-On安定細胞株の場合、GOIの誘導はRT-qPCRによって検証し、無菌試験やマイコプラズマ検出試験など、一連の標準的なQCを行い、合格した細胞を納品します。

Tet誘導性遺伝子発現安定細胞株の価格と作業日数 表示する
安定細胞株モデル 作製方法 納品物 価格 (消費税・送料別) 作業日数
tTS/rtTA 発現型安定細胞株 レンチウイルス 細胞プール 286,000円より 7-9 週間
3系統 546,000円より 9-15 週間
Tet-On遺伝子発現型安定細胞株 レンチウイルス 細胞プール 468,000円より 10-16 週間
3系統 767,000円より 13-21 週間

安定細胞株樹立受託サービスの詳細

技術的情報

テトラサイクリン誘導性遺伝子発現

テトラサイクリン誘導性遺伝子発現システムは、哺乳類細胞における遺伝子発現のタイミングを制御するための強力なツールです(図1)。VectorBuilderでは、Tet-OnシステムとTet-Offシステムの両方のカスタムベクター構築サービスを提供しています。非常に特異的に、かつテトラサイクリン用量依存的に、目的遺伝子の発現調節が可能です。  

ベクタービルダーのTet-Onベクターシステムは、テトラサイクリンの非存在下でGOIのほぼ完全なサイレンシングを担い、テトラサイクリンが添加されると、濃度依存的に応答し、強力で迅速なGOIの発現を誘導します。この分子メカニズムには、互いに転写調節機能に拮抗するtTSタンパク質とrtTAタンパク質をベクターシステムに組み込むことで実現れています。テトラサイクリンが非存在下では、TetR(Tetリプレッサータンパク質)とKRAB-AB(Kid-1タンパク質の転写リプレッサードメイン)融合タンパク質であるtTSタンパク質が、TREプロモーターに結合し、遺伝子転写の積極的なサイレンシングを行っています。一方、rTetR(変異型Tetリプレッサー)とVP16(単純ヘルペスウイルスのビリオンタンパク質16の転写活性化ドメイン)の融合タンパク質でるrtTAタンパク質が、テトラサイクリンの存在下でTREプロモーターに結合すると、遺伝子転写を強力に誘導します。

図1. Tet-OnとTet-Offシステムを使用したTet調節遺伝子発現のメカニズム。Dox: ドキシサイクリン (doxycycline, テトラサイクリンアナログ)

Tet誘導性遺伝子発現システムは、以下の表に要約されているような、他のシステムに比べた利点があります。そのため他の誘導性遺伝子発現システムに比べてよく使用されます:

Tet誘導性遺伝子発現システム 他の誘導性遺伝子発現システム 
調節メカニズム テトラサイクリンの非存在下ではリーキーなGOI発現が最小にする。 基底レベルのトランスジーンの発現に応答して、インデューサーの非存在下では高いリーキーなGOI発現が発生する。例:タモキシフェンシステム、リボスイッチシステムなど。
遺伝子発現誘導レベル  テトラサイクリンの存在下でターゲット遺伝子の発現誘導レベルが急激に1,000倍ほどまで上昇する。 タモキシフェンシステム、リボスイッチシステムなどでは、ターゲット遺伝子の発現誘導が 100倍とはるかに低い。
可逆性か テトラサイクリンの添加・除去によって遺伝子発現を可逆的に操作できる。 タモキシフェンシステムでは遺伝子発現の不可逆的な活性化をもたらす。
毒性 非毒性レベルのドキシサイクリンを使うと高レベルの誘導ができる。 タモキシフェンシステムでは細胞毒性が上昇する。
試薬コスト テトラサイクリンやドキシサイクリンは安価で入手が容易な試薬。

ホルモンを使った誘導システムでは試薬が高価。

多面的効果(Pleiotropic effects) 原核生物の調節シークエンスは哺乳類細胞には存在しないため、多面的影響が縮小される。 エクダイソンシステムや CIDシステムなどの場合、非標的内因性遺伝子の活性化による多面発現効果が増加する。
オールインワン(All-in-one)ベクターデザイン対デュアル(dual)ベクターデザイン

テトラサイクリンによって調節されるGOI発現誘導または阻害には、標的細胞にてTREプロモーターとTet調節タンパク質(tTA、tTS、および/またはrtTA)によって駆動されるGOIが同時発現することが必要です。そのためには、GOIとTetの両方の調節タンパク質を同じベクター(別名オールインワンベクター)から発現させるか、またはGOIとTetの調節タンパク質を別々のベクター(デュアルベクター)から発現させる方法があります。オールインワンベクターの利点は、1ベクターでTet調節遺伝子発現に必要なすべてのコンポーネントを細胞にデリバリーできるため、技術的に容易なことです。デュアルベクターでは2つの別々のプラスミド/ウイルスによる標的細胞の同時トランスフェクション/同時形質導入が必要です。全ての細胞が両方のプラスミド/ウイルスでトランスフェクト/形質導入されるわけではないため、技術的にチャレンジングな場合もあります。デュアルベクターの代替アプローチとしては、Tet調節タンパク質を安定して発現する細胞または生物に、GOIプラスミド/ウイルスをトランスフェクト/形質導入することです。ただし、この方法は細胞や動物の確立に時間と労力を要します。このようにネガティブな印象のあるデュアルベクターシステムですが、すでにTet調節タンパク質を安定発現する細胞や動物を確立してしまえば、複数の異なるGOI発現プラスミド/ウイルスを均一の条件下で発現できるため、よい比較実験系が組める利点が好まれています。

組織特異的Tet誘導性遺伝子発現

VectorBuilderは、標準と低リークの2形式のオールインワン(Tet-On)ベクターを提供し、組織特異的GOI誘導を行えるようにしています。標準Tet-Onベクターシステムは、ユーザーが選択した組織特異的プロモーターによって駆動されるtTSとrtTAを誘導タンパク質として発現します。対して、低リークTet-Onベクターシステムは、ユビキタスプロモーターでtTSの発現を調節し、ユーザー選択の組織特異的プロモーターがrtTA発現を調節します。そのため低リークデザインでは、テトラサイクリンの非存在下で非標的組織でのリーク発現を最小限に抑えながら、テトラサイクリンの存在下でGOIの組織特異的誘導を可能にするという優れた利点を持っています。

VectorBuilderのオンライン “リソース” > “インストラクション” には、Tet誘導性遺伝子発現実験の計画、方法、トラブルシューティングなどのガイドがご覧いただけます。

Tet誘導性ベクターシステムのガイド
Tetベクターのコンポーネントのガイド 
関連技術情報
ユーザーインストラクション

Q&A

Tet-OnベクターシステムではrtTAのみ、またはtTS/rtTAを使うべきでしょうか?

rtTAのみに依存するTet-OnシステムではリーキーなGOIの発現が観察されてしまうことが弱点です。それに対して、tTS / rtTAを使うTet-Onベクターシステムは、テトラサイクリンの添加・除去を行うことで、遺伝子発現をオン/オフでき、かつリーキーなGOI発現を最小限に抑えます。そのためGOI発現をダイナミックに制御できます(図2)。この分子メカニズムは、テトラサイクリン非存在下での、tTSタンパク質のTREプロモーターへの結合による遺伝子転写の積極的な抑制、そしてテトラサイクリン存在下での、rtTAタンパク質のTREプロモーターへの結合による高感度の遺伝子転写の活性化によって制御されています。

- Dox+ Dox

rtTA tTS/rtTA
Inducible Tet-on vector transfection image

図2. 293T細胞でのEGFP発現の検証。 EGFPとrtTA を発現するall-in-one (Tet-On) (上段) 、EGFPとtTS/rtTAanを発現するall-in-one (Tet-On) (下段)。トランスフェクションから48時間後のEGFPの発現をドキシサイクリンの非存在下(-Dox) または存在下(+Dox) で比較している。

Tetシステムのコンポーネントをレンチウイルスで遺伝子導入するには、all-in-oneとdualベクターシステムのどちらが適していますか?

レンチウイルスを使用してTetシステムコンポーネントをデリバリーする場合、通常オールインワンのベクターはお勧めしていません。当社の内部R&Dデータと多くのお客様からのフィードバックに基づくと、オールインワンのレンチウイルスを使用した遺伝子誘導効率は状況によって様々で、満足いく結果が得ずらいとのことです。オールインワンベクターには通常、2つの遺伝子発現カセットが含まれています。TREプロモーターによって駆動されるGOI発現カセットと、Tet調節タンパク質(tTA、tTS、rtTAなど)の発現カセットです。レンチウイルスでは、5'と3'の両LTRで挟まれた内部領域に、ポリAシグナルを入れることができません。もし内部にポリAシグナルが存在すると、ウイルスパッケージングを阻害します。しかし複数の発現カセットを組み込む場合、各3’末にポリAシグナルを入れる必要があり、ポリAが付加されなければ異なるカセットの独立発現が制御できません。もし発現カセットの3’側にポリAを入れなかった場合、上流の発現カセットがORFの終わりで止まらず、下流プロモーターORFの転写も続けて下流ORFの発現が大幅に低下してしまいます。Tetオールインワンベクターでは、Tet調節タンパク質がGOIの下流にあります。Tet調節タンパク質の発現が大幅に低下してしまうと、GOI発現のリークから非効率的なGOI発現誘導が生じます。このように両方の必須要件に矛盾が生じるためレンチウイルスではオールインワンベクターがうまく働かないのです(図 3)。

- Dox+ Dox

Dual
All-in-one
Inducible Tet-on vector transduced with lentivirus image

図3.  293T細胞にデュアル(Tet-On) レンチウイルス(上段)またはオールインワン(Tet-On)レンチウイルス(下段)を形質導入しレポーターEGFPの発現を検証した。デュアルベクターを使った形質導入ではtTS/rtTAを安定発現する293T細胞を使い、TREで駆動されるEGFPをレンチウイルスを使って形質導入した。トランスフェクションから48時間後のEGFPの発現をドキシサイクリンの非存在下(-Dox) または存在下(+Dox) で比較している。

どのベクターシステムを使うべきでしょうか?

成功する実験デザインの重要要素の1つは、目的遺伝子を標的細胞にデリバリーするベクターシステムの選択です。さまざまなウイルスおよび非ウイルスベクターがオプションとして選択可能な場合、実験計画に適した理想的なベクターを選択する際の重要な代表的な考慮されるべき事項は次の通りです。目的の細胞はトランスフェクションが容易ですか、それとも困難ですか?一過性の発現または宿主ゲノムへの安定挿入が必要ですか?目的遺伝子をドライブするためにカスタマイズされたプロモーターを使用する必要がありますか?ベクターは細胞培養またはinvivoのどちら(または両方)に使用されますか?条件付き、または誘導性遺伝子発現が必要ですか?GOIのサイズはベクターにクローニングできるサイズですか?

下の表は、一般的に使用されるベクターシステムと、実験計画に適したベクターを選択するための手引きです。

標準的なプラスミドベクター ウイルスベクター トランスポゾンベースベクター
トランスフェクション可 不可
一過性発現または安定発現 一過性 宿主ゲノムへの挿入による安定発現 宿主ゲノムへの挿入による安定発現
パッケージングの必要性 不必要 必要 不必要
搭載サイズ 大きい 小さい~中程度 中程度~大規模
推奨使用系 培養細胞 培養細胞& In vivo 培養細胞& in vivo
プロモーターカスタマイズ ウイルスタイプによって異なる