BAC編集（リコンビニアリング）受託サービス

培養細胞や生体で目的遺伝子を導入/発現する用途には標準的なプラスミドベクターが最もポピュラーですが、運搬できるDNAサイズが30kbまでに制限されます。一方でBACは300kbまでのDNAをクローニングし、大腸菌内で安定維持できます。BACは大腸菌のF因子ファクタープラスミドを由来としており、細胞内で1コピーで維持されるためにリアランジメントの可能性が低く、高コピープラスミドと比べて安定しています。ほとんどのBACは様々なバイオリソースセンター(BACPACリソースセンター、シロイヌナズナリソースセンター、サンガー研究所、INRA BAC-YACリソースセンターまたは商用リソースなど)から安価で確実に入手できます。BACはBAC編集による遺伝子操作によって簡単で素早く改変できます。

大きなサイズのDNAを安定して運搬でき、比較的簡単に操作ができることからBACは複数のモデル生物（ヒト、マウス、イロイヌナズナなど）のゲノムシークエンス計画に利用されています。他のBAC利用法としては、１）BACライブラリースクリーニング、２）疾患関連遺伝子の領域クローニング、３）様々な疾患やシグナル経路の研究用途に、野生型、変異型、レポータータグ付き遺伝子、もしくは転写制御因子が導入されたトランスジェニック細胞株やトランスジェニックマウスの作製、４）ウイルス起因の感染症研究のためにヘルペスウイルスなどのDNAまたはRNAウイルスゲノムが組み込まれたBACの作製、などがあります。

1ステップBAC編集はプロモーターの下流にレポーターを配置して遺伝子発現を追跡するなどの大規模な配列編集（図１）や、点変異のなどの小規模な配列編集（図2）を導入するために使われます。

大規模な編集の場合は（図1）相同性組み換えによって、BAC上の標的領域がLacZやGFPなどの目的遺伝子（GOI）とFRTサイトに挟まれた薬剤選択用カセットに置き換わります。薬剤選択用カセットは正しくBAC編集が行われたクローンの同定に役立ちます。当カセットはFlpリコンビナーゼによって取り除かれ、FRTサイトが残されます。

図1. LacZやGFPレポーターを目的遺伝子(GOI)プロモーター下流に連結する１ステップBAC編集の概要図

点変異の場合（図２）、相同性組み換えによって、BAC上の対応する標的領域が変異を含むDNA断片とFRTサイトに挟まれた薬剤選択用カセットに置き換わります。のちに薬剤選択用カセットはFlpリコンビナーゼによって取り除かれ、FRTサイトが残されます。FRTサイトは導入された点変異とともに、BAC編集された後の“傷跡”として残ります。“傷跡”FRTサイトが遺伝子機能に影響を与えないように、イントロンやUTRのような機能性のない領域に配置されるように設計してください。

図２. 点変異を第１エクソンに、FRT“傷跡”サイトを下流のイントロンに導入する１ステップBAC編集の概要図

２ステップBAC編集はFRT“傷跡”サイトを残さずに点変異などの小規模な編集を実行できます(図３)。この方法は標的変異配列の周辺にFRT“傷跡”サイトを残すことができない場合に適しています。例えば、標的とする遺伝子が非常に大きな単一エクソンから構成されており、変異を導入したい配列が遺伝子の中央にあるためにFRT“傷跡”サイトを残すことができない場合などは2ステップBAC編集が有用です。２ステップBAC編集はポジティブ/ネガティブ選択が可能な薬剤選択用カセットを利用します(図３)。はじめに、相同性組み換えによって標的配列をポジティブ/ネガティブ選択用カセットで置き換えます。この段階ではポジティブ選択を利用します。つぎに、相同性組み換えによってポジティブ/ネガティブ選択用カセットを希望する変異が導入されている配列で置き換えます。この段階ではネガティブ選択を利用します。この2ステップの操作によって、FRT“傷跡”サイトをもたないBAC編集が可能になります。

図３. FRT“傷跡”サイトを残さずに巨大なエクソンを持つ遺伝子の中央に点変異を導入する2ステップBAC編集の概要図

ネオマイシン耐性遺伝子などの薬剤選択マーカーやEGFPなどの可視化マーカーをBACバックボーンに追加することで、BAC導入が成功した細胞の選別が容易になります。薬剤選択は安定的にBAC導入されている細胞を同定したい場合に役立ちます。ほとんどのBACのバックボーンにはloxPサイトが組み込まれているので任意マーカーの発現カセットを挿入することができます。

BAC上の特定配列をプラスミドに移し替えることで、BACのその他の配列の影響を取り除いたうえで、その特定配列の解析を行うことができます。たとえば、複数遺伝子を含むBACを使ってトランスジェニックマウスを作製して特定の遺伝子の機能解析をおこなう場合、その他の遺伝子の影響を無視してトランスジェニックマウスの表現型を解釈することはできません。特定の遺伝子を移し替えたプラスミドを使用してトランスジェニックマウスを作製すれば、このような問題を回避できます。BACよりもプラスミドのほうが扱いが容易なことも利点となります。当社は60kbまでならば、どのようなDNA配列でもBACからプラスミドに移し替える事ができます。