目的遺伝子のノックダウン評価には何種類のshRNAを試すべきか

shRNAを使用する時には、すべてのshRNAがうまく機能するわけではないこと念頭に入れてください。shRNAを経験に基づいて設計すると、頻繁にノックダウン効率の特異性と効率性のばらつきが生じます。shRNAの機能性は長さ、ループ構造、GC含有率、熱力学的安定性、標的配列の二次構造、オフターゲット配列の有無などの要因によって決定されます。通常、50‐70%のshRNAは、判別可能なレベルのノックダウン効果を示し、20‐30%は顕著なノックダウンをもたらします。その為、目的遺伝子のノックダウンのために最も効果的なshRNAを決定するために複数のshRNAをテストすることが重要になります。

当社の経験とお客様からのフィードバックに基づくと、通常、任意の遺伝子に対して3‐4種のshRNAをテストした場合、2-3種は十分なノックダウン効果を得ることができています。少数のshRNAしかテストしない場合、満足できるレベルのノックダウン効果を得ることができない可能性があります。そのような場合は別のshRNA、特に論文で使用されているshRNAをテストすることを推奨します。一つの遺伝子に対してshRNAカクテル(複数shRNAの混合物)を使用することでノックダウン効果を改善する方法もあります。

ベクタービルダー社はポピュラーな生物種に対して最適化されたshRNAのデータベースを用意しています。データベース内のshRNAはRNAiコンソーシアムで利用されるルールを用いて設計、スコア化されています。当社のオンライン設計ツールを使用してshRNAベクターを設計する時には、目的遺伝子を当社のデータベースで検索することもできます。目的遺伝子を入力していただければ、当社の設計したshRNAのすべての詳細な情報(shRNAのゲノム上での場所及びすべてのスプライシングバリアントが表示されるUCSCゲノムブラウザへのリンクなど)を閲覧できます。当社のデータベースは設計されたすべてのshRNAをノックダウンスコアによってランク付けします。ノックダウンスコアの高い、上から3つのshRNAをテストすることを推奨しています。

shRNAノックダウンスコアの計算方法についてはこちらを参照してください。 

長期間の遺伝子ノックダウンを目的とするならばレンチウイルスベクターが最も適しています。しかし、レンチウイルスベクターに関連した技術的な困難さと高いコストを避けるために、shRNA候補の検証段階では標準的なプラスミドベクターを使う選択肢もあります。最もノックダウン効率が高いshRNAが決定された後は、そのshRNAをレンチウイルスベクターに組み込んで標的遺伝子の安定したノックダウンを実現できます。