gRNAターゲットデザイン

CRISPRの基本

CRISPR/Cas9遺伝子編集システムは、遺伝子ノックアウト、ノックイン、活性化、および阻害など、さまざまな遺伝子改変に使用され、細胞・動物モデルにおける遺伝子機能の特定からヒトの疾患原因遺伝子の編集に至るまで、広範な分野での応用が可能となっています。

CRISPR/Cas9システムには、Cas9エンドヌクレアーゼとガイドRNA（gRNA）という2つの重要なコンポーネントがあります。gRNAは短いRNA配列であり、ターゲットゲノム内の相補的なDNAに結合することにより、Cas9をターゲット部位に誘導します。Cas9はRNAガイド型のDNAエンドヌクレアーゼであり、ターゲット配列がPAM（Protospacer Adjacent Motif）として知られる短いDNAモチーフに隣接している場合に、特定のゲノム位置で二本鎖切断（DSB）を入れます。ターゲット部位にDSBが起きると、細胞は非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え修復（HDR）経路のいずれかを使用して切断を修復します（図1）。

NHEJは遺伝子ノックアウトの作成を促進しますが、精度に欠け、様々に編集されたの不均一な細胞集団を生成します。一方、HDRはドナーDNAテンプレートを元に修復されるため、DSB部位での計画的な点変異や大きな断片のノックイン・ノックアウトなど、正確な編集を可能にします。

図1. CRISPR/Cas9によって誘導されるDNA修復のメカニズム

gRNAの設計

gRNAは主に2つの部分、ガイド配列とスキャフォールド配列で構成されています。ガイド配列は、PAM部位の隣にあるターゲットDNAに相補的な配列で、可変領域です。スキャフォールド配列は、図2に示すように、Cas9結合に必要なステムループ構造を形成する約80ヌクレオチドの定常領域です。ほとんどのCRISPRアプリケーションでは、実験の簡便化のため、ガイドとスキャフォールドは一本鎖ガイドRNA（sgRNA）として融合させて使用します。CRISPRアプリケーションを成功させるには、ガイド配列は特異性を確保しつつオフターゲット効果を最小限に抑えるのに十分な長さである必要があり、通常は約20塩基で、GC含量は40〜60%にします。

図2. spCas9特異的スキャフォールド配列を持つsgRNAの構造

gRNAを設計するにあたり、高いオンターゲット効率を確保し、オフターゲット効果のリスクを最小限に抑えることが重要です。単純な遺伝子ノックアウトなど、ほとんどの用途では適切な単一のgRNA（single gRNA）と適合するCasの2つで目的の表現型を十分誘導できます。しかし、デュアル（dual） gRNAを選択した方が良い場合もあります。例えば、Cas9(D10A)ニッカーゼを、同じ領域の反対側の鎖を標的としてずれた位置を認識する２種類のgRNAと組み合わせて使用​​することで、二本鎖切断を作成でき、これによりオフターゲット効果が減少します（図3）。デュアルgRNAは、gRNAペアによって誘導される2つのDSB間に位置するDNA断片を欠失させたい場合や、2つの異なる遺伝子を同時にターゲットするためにも使用されます。gRNAは、選択されたCas9バリアントに依存するPAM配列の近傍領域を標的にする必要があります。したがって、使用する特定のCas9バリアントとのgRNAの互換性を確保することが重要です。さらに、ガイド配列がターゲットDNAとのペアリングができなくなり、編集効率が低下する可能性があるため、gRNA内の二次構造は最小限に抑える必要があります。

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図3. 2種類のgRNAとたニッカーゼ活性を利用した二重鎖切断