Tol2型 コンディショナルノックアウトベクター（Floxed）

概要

Tol2コンディショナル遺伝子ノックアウトベクターシステムは、VectorBuilderの高効率なTol2ベクターシステムとCre応答性遺伝子ノックアウトシステムを組み合わせています。これにより、哺乳類細胞および動物において、トランスフェクションによってCreを介したコンディショナルノックアウトシステムを宿主ゲノムへ恒久的に組み込むことが可能になります。このFloxedシステムは、目的遺伝子をLoxP組み換えサイトで挟むことで、Cre依存的なコーディング配列の欠失による遺伝子発現の不活性化を促進します。Creリコンビナーゼが存在しない場合、目的遺伝子の発現は維持されます。このベクターを保持する細胞にCreを導入すると、目的遺伝子は恒久的に切り出されます。

Tol2ベクターシステムは技術的に簡便であり、ウイルスによる形質導入ではなくトランスフェクションを利用して、目的遺伝子を宿主ゲノムに恒久的に組み込みます。Tol2システムは、トランスポゾンプラスミドとトランスポゼースの2つのコンポーネントで構成されます。トランスポゾンプラスミドは、転位させる領域を挟む2つの逆向き末端反復配列（ITR）を含んでいます。上述のLoxPで挟まれた目的遺伝子がこの領域にクローニングされます。Tol2トランスポゼースを導入すると、トランスポゾンのITR間の領域が宿主ゲノムに組み込まれます。その後、Creリコンビナーゼ存在下で、コーディング配列をCre依存的に反転させることにより、遺伝子発現を不活化することができます。

トランスポゼースは、2つの方法で標的細胞に導入できます。一つはヘルパープラスミドを細胞に一過性にトランスフェクションする方法です。もう一つは、ヘルパープラスミドからin vitro転写によって生成されたトランスポゼースmRNAを標的細胞に注入する方法です。トランスポゾンプラスミドとトランスポゼースが標的細胞に同時に導入されると、ヘルパープラスミド（またはmRNA）から産生されたトランスポゼースがトランスポゾン上の2つのITRを認識し、ITRを含む挟まれた領域を宿主ゲノムに挿入します。Tol2トランスポゼースは配列挿入部位の両端に相同な8塩基長の反復配列を生み出します。その他のトランスポゾンシステムとは異なり、Tol2トランスポゾンは挿入箇所に特別な配列バイアスがありません。piggyBacトランスポゾンを例にすると、TTAA配列を含む部位が挿入の標的となります。どちらのトランスポゼース導入方法を用いても、トランスポゼースは短期間しか発現しません。ヘルパープラスミドの消失またはトランスポゼースmRNAの分解に伴い、トランスポゾンの宿主ゲノムへの組み込みは恒久的なものとなります。Tol2は、カット＆ペースト型のクラスIIトランスポゾンに分類され、自己コピーを残さずに転移します（クラスIトランスポゾンは、コピー＆ペースト型で、自己コピーを残して転移します）。Tol2トランスポゼースを再び導入することにより、ゲノムに痕跡を残すことなくTol2トランスポゾンを取り除くことができます。その際には痕跡を残さない場合と、欠失が生じる場合があります。

このベクターシステムは組織培養細胞でも使用できますが、特にトランスジェニック動物の作製に適しています。このようなベクターを保持するトランスジェニック動物を、組織特異的なCreトランスジーンを保持する動物と交配させると、両方のトランスジーンを保持する子孫動物において、組織特異的Creが発現し、かつ目的遺伝子を駆動するユーザー選択のプロモーターが活性化している細胞でのみ、目的遺伝子がオフになります。

このベクターシステムとCre標的の組み換えに関する詳細については、下記の論文を参照してください。

特長

このTol2コンディショナル遺伝子ノックアウトベクターは、哺乳類細胞および動物におけるCreを介したコンディショナルノックアウト用に設計されています。目的遺伝子の発現は、最初は選択したプロモーターの制御下で発現しますが、Creリコンビナーゼの共発現によって目的遺伝子をコードする領域を恒久的に切り出すことで、その発現を恒久的にサイレンシングできます。本ベクターは、Tol2トランスポゼースをコードするヘルパープラスミドとともに、大腸菌での高コピー数複製、幅広い標的細胞への効率的なトランスフェクション、およびベクター上に搭載されたトランスジーンの高レベル発現のために最適化されています。本ベクターは、大腸菌での高コピー数複製、標的細胞への高効率トランスフェクション、および高レベルの導入遺伝子発現のために最適化されています。

メリット

安定した遺伝子不活性化: Creリコンビナーゼによる処理は、目的遺伝子をコードする配列を恒久的に除去し、その転写を阻害します。

ベクターDNAの恒久的な組み込み: 従来の方法で宿主細胞へ導入されたベクターDNAはほとんどが時間経過とともに失われます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になりますTol2トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミド（トランスポゼース発現）を使用した遺伝子導入法ならば、トランスポゾンの宿主ゲノムへの挿入によって恒久的な目的遺伝子の導入が可能です。

技術的簡便性: トランスフェクション法によるプラスミドベクターの導入は、ウイルスパッケージングを必要とするウイルスベクターよりも、はるかに簡単な技術で行うことができます。

非常に大きな搭載容量: 当社のTol2コンディショナル遺伝子ノックアウトベクターは～11kbのDNAを搭載することができます。ベクターバックボーン領域とトランスポゾン関連配列の3kbを差し引いても、目的遺伝子の挿入には十分なスペースが用意されています。

デメリット

限定的な細胞種の範囲: Tol2ベクターの細胞への導入はトランスフェクションに依存します。プラスミド導入の効率は細胞種によって大きく異なり、多くの場合は最適化が必要です。プライマリー（初代培養）細胞は不死化細胞株よりもトランスフェクションが困難であることが多いです。神経細胞や膵臓β細胞などの一部の重要な細胞種は、トランスフェクションが極めて難しいことで知られています。これらの問題がTol2システムの使用を制限しています。

基本コンポーネント

5' ITR: 5’末端逆向き反復配列。Tol2トランスポザーゼが両末端のITRを認識し、ITRとITR間にデザインされたDNA領域を宿主ゲノムに挿入します。

Promoter: 目的遺伝子を発現させるためのプロモーターをここに配置します。

LoxP: Creリコンビナーゼの組換え配列。Creが存在下で2つのLoxP配列間の領域が切り出されます。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核生物における翻訳開始を促進すると考えられているため、目的のORFの開始コドンの直前に配置されます。

ORF: 目的遺伝子のオープンリーディングフレーム（Open reading frame）をここに配置します。

SV40 late pA: シミアンウイルス40後期ポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

hPGK promoter: ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター。下流マーカー遺伝子の発現をユビキタスに駆動します。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）や視覚化用遺伝子（EGFPなど）、もしくはデュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にします。

3' ITR: Tol2 3' 末端逆向き反復配列。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。