Sleeping Beauty型 コンディショナルノックアウトベクター（Floxed）

概要

このSleeping Beautyコンディショナル遺伝子ノックアウトベクターシステムは、哺乳類細胞および動物においてCreを介したコンディショナルノックアウトシステムを利用します。このFloxedシステムは、目的遺伝子の両端にLoxP組換え部位を配置し、Cre依存的にコーディング配列を欠失させることで遺伝子発現の不活化を誘導します。Creリコンビナーゼが存在しない場合、目的遺伝子の発現は維持されます。このベクターを保持する細胞にCreを導入すると、目的遺伝子は恒久的に切除されます。

当社のSleeping Beautyコンディショナル遺伝子ノックアウトベクターは、LoxPで挟まれた目的遺伝子を非ウイルス性のトランスポゾンを用いて標的細胞へ導入するための非常に効率的なツールです。このベクターシステムは、魚類ゲノムで見つかった Tc1/mariner トランスポゾンを利用しています。魚類ゲノム中ではすでに変異の蓄積のためにトランスポゾンとしての転位活性を失っていました。そのため、サケのTc1/marinerトランスポゾンシークエンスから変異を修正することでSleeping Beautyトランスポゾンとして再構築されました。

Sleeping Beautyシステムは、トランスポゾンプラスミドとトランスポゼース（ヘルパー）の2つのコンポーネントで構成されます。トランスポゾンプラスミドには、転位される領域の両脇に2つのIR/DRが含まれています。トランスポゾンプラスミドとトランスポゼースが同時に細胞へ導入されると、2つのIR/DRに挟まれた転移領域をゲノム中のTA配列に挿入します。配列挿入に伴ってTA配列が複製されて転移領域の両端に出現します。トランスポゼースは、1）一過的なヘルパープラスミドのトランスフェクションもしくは、２）IVT (in vitro transcribed) トランスポゼースmRNAを目的細胞へマイクロインジェクションする、2通りの方法でトランスポゾンを目的細胞にデリバリーできます。どちらの方法でも、トランスポゼースは短い間のみ発現します。ヘルパープラスミドの消失もしくはトランスポゼースmRNAの分解によってゲノムに挿入されたトランスポゾンは安定化します。

Sleeping Beautyは、カット＆ペースト型のクラスIIトランスポゾンに分類され、自己コピーを残さずに転移します（クラスIトランスポゾンは、コピー＆ペースト型で、自己コピーを残して転移します）。sleeping beautyヘルパープラスミドを再び導入することにより、ゲノムに痕跡を残すことなくsleeping beautyトランスポゾンを取り除くことができます。その際に転移の痕跡として複製されたTA配列に挟まれた3塩基配列（トランスポゾン・フット・プリント）が残されます。

細胞培養でこのベクターシステムを使用する場合、薬剤耐や蛍光色素遺伝子をマーカーとしてベクターに追加することで、ベクターがゲノムに恒久的に組み込まれた細胞の単離やトランスフェクションされた細胞の選択や可視化が可能になります。なお、本ベクター単独では2つのLoxP部位間の組み換えを起こすことはできません。ヘルパーベクターやCreをコードするmRNAなどを介したCreの共発現が必要です。

当ベクターシステムおよびCreを介した組換えに関する詳細な情報については、下記の文献を参照してください。

特長

このSleeping Beautyトランスポゾンを用いたベクターは、哺乳類細胞および動物におけるCreを介したコンディショナルノックアウト用に設計されています。目的遺伝子の発現は、最初は選択したプロモーターの制御下で発現しますが、Creリコンビナーゼの共発現によって目的遺伝子をコードする領域を恒久的に切り出すことで、その発現を恒久的にサイレンシングできます。

メリット

安定した遺伝子不活性化: Creリコンビナーゼによる処理は、目的遺伝子をコードする配列を恒久的に除去し、その転写を阻害します。

ベクターDNAの恒久的な組み込み: 従来の方法で宿主細胞へ導入されたベクターDNAはほとんどが時間経過とともに失われます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。Sleeping Beautyトランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミド（トランスポゼース発現）を使用した遺伝子導入法ならば、トランスポゾンの宿主ゲノムへの挿入によって恒久的な目的遺伝子の導入が可能です。

技術的簡便性: トランスフェクション法によるプラスミドベクターの導入は、ウイルスパッケージングを必要とするウイルスベクターよりも、はるかに簡単な技術で行うことができます。

デメリット

限定的な細胞種の範囲: Sleeping Beautyトランスポゾンベクターの細胞への導入はトランスフェクションに依存します。プラスミド導入の効率は細胞種によって大きく異なり、多くの場合は最適化が必要です。プライマリー（初代培養）細胞は不死化細胞株よりもトランスフェクションが困難であることが多いです。神経細胞や膵臓β細胞などの一部の重要な細胞種は、トランスフェクションが極めて難しいことで知られています。さらに、プラスミドトランスフェクションは主にin vitroでの用途に限定され、in vivoで使用されることは稀です。これらの問題がSleeping Beautyシステムの使用を制限しています。

限定的な転移可能サイズ: 1.9kbから7.2kbのサイズのDNA配列を転移できます。転移サイズが大きくなると効率が低下します。

基本コンポーネント

TATA: TAジヌクレオチド塩基対。Sleeping Beautyの転位効率を高めます。

IR/DR(L): Sleeping Beautyトランスポゾンの逆向き反復配列／直列反復配列(左側)。Sleeping Beautyトランスポゼースによって認識されます。IR/DR(L)とIR/DR(R)の間にデザインされたフラグメントは、Sleeping Beautyトランスポゼースによって、TAジヌクレオチド塩基対に転位挿入されます。

Promoter: 目的遺伝子を発現させるためのプロモーターをここに配置します。

LoxP: Creリコンビナーゼの組換え配列。Creが存在下で2つのLoxP配列間の領域が切り出されます。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核生物における翻訳開始を促進すると考えられているため、目的のORFの開始コドンの直前に配置されます。

ORF: 目的遺伝子のオープンリーディングフレーム（Open reading frame）をここに配置します。

BGH pA: ウシ成長ホルモンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

hPGK promoter: ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター。下流マーカー遺伝子の発現をユビキタスに駆動します。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）や視覚化用遺伝子（EGFPなど）、もしくはデュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にします。

IR/DR(R): Sleeping Beautyトランスポゾンの逆向き/直接反復配列（右側）。Sleeping Beautyトランスポゼースによって認識されます。IR/DR(L)とIR/DR(R)の間にデザインされたフラグメントは、Sleeping Beautyトランスポゼースによって、TAジヌクレオチド塩基対に転位挿入されます。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。