標準プラスミドHITI遺伝子ターゲティングドナーベクター

概要

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます（同様にZFNやTALENなどもよく利用されます）。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原核生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA（gRNA）と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

Cas9の標的DNA配列切断によって生じるDSB（double-strand break）は2種類の経路（非相同性末端結合（nonhomologous end-joining pathway：NHEJ）と相同組み換え修復（homology-directed repair：HDR））によって修復されます。DSBは主にNHEJによって修復され、NHEJによるDSB修復は高頻度で小規模な配列欠損（稀に配列挿入及び塩基置換）を生じます。そのような変異が遺伝子のタンパク質翻訳領域で発生すると（欠損、挿入が原因となるフレームシフトによって）、遺伝子機能の破壊につながります。効率は低くなりますが、CRISPR/Cas9コンポーネントと外来性ドナーDNAテンプレートを同時に導入することによってHDRによるDSB修復も可能です。HDRによって標的ゲノムDNA配列はDNAテンプレート配列に組み換えられるため、点変異やDNA配列のノックインなど大幅な改変が可能になります。

当社の遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターを利用することで標的ゲノム配列にレポーター、蛍光タグ、その他の任意の配列を挿入するための外来性ドナーDNAテンプレートを効率的に構築できます。HITI（homology-independent targeted integratio；ホモロジー非依存性標的挿入）ドナーベクターは、NHEJのメカニズムを利用することで、分裂細胞と非分裂細胞のいずれにおいてもより高い組換え効率が得られます。本ベクターは、宿主ゲノム内の切断部位と一致する上流と下流の標的配列に任意の挿入配列を挟むよう設計されています。これらの配列には、gRNAのための標的配列とCas9認識のためのPAM配列の両方を含んでいることが必須です。

NHEJを介した組込み用のHITIドナーベクターを設計する場合、任意の挿入配列において、希望配列の挿入後にDSBが再度起きないようにすることが重要で、例えば、挿入した配列からPAM配列を排除または不活性化させます。

CRISPRターゲッティングの欠点のひとつは標的配列以外を切断してしまうオフターゲット活性ですので、オフターゲット活性スコアが最小になるように慎重にgRNA標的配列を選ぶ必要があります。さらに、宿主DNAを標的とするデュアルgRNA配列とドナーベクター上の「ベイト」配列を使用することで、オフターゲット統合を最小限に抑えることができます。

当ベクターシステムの情報の詳細については、下記の文献を参照してください。

特長

当社の遺伝子ターゲティングHITIドナーベクターは、目的のゲノム標的配列にレポーター、蛍光タグ、または他の任意の配列を非常に効率良くかつ特異的にNHEJを介して挿入するよう設計されています。ドナーベクターは、Cas9/gRNAによってターゲットとされる上流と下流の配列で任意のドナー配列が挟まれるよう設計されており、ゲノムベクター標的配列とドナーベクター標的配列のいずれにおいてもDSB後の効率良い挿入が容易です。

メリット

部位特異的変化: 遺伝子ターゲティング用ドナーベクターの形で外来性修復テンプレートを挿入することで、目的のゲノム標的配列における配列変化のNHEJを介した導入が可能です。

効率のより高い組込み: NHEJ修復がすべての細胞周期で生じ、分裂細胞と非分裂細胞のいずれにおいても組込みが簡単です。NHEJはHDR修復機構よりも効率が良い反面、多くの細胞は組込みをすることなく修復されます。そのため、標的細胞は入念にスクリーニングされる必要があります。

技術的な簡便さ: 従来通りの遺伝子導入法をもちいて遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターをCas9と標的配列特異的なgRNA配列とともに哺乳類細胞に導入することでNHEJを介したゲノム編集を行えます。パッケージングなどが必要なウイルスによる遺伝子導入と比べて、従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入は簡便です。

デメリット

細胞タイプが限定される: プラスミドベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。非増殖細胞は一般的に増殖細胞よりも効率が悪く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。プラスミドによる遺伝子導入はin vitro用途に限定され、in vivo用途にはほとんど使用されません。

PAM配列が必要: CRISPR/Cas9標的配列はgRNA認識配列の3‘末端直後にPAM配列として“NGG“が必要です。Cas9が挿入した配列を再切断してしまう可能性を排除するためにPAM配列を取り除くか改変する必要があります。

基本コンポーネント

CRISPR 標的配列 1: 1つめのCRISPR標的配列。

ドナー配列/カセット: 標的ゲノムサイトにノックインする挿入配列。

CRISPR 標的配列 2: 2つめのCRISPR標的配列。

MC1 プロモーター: ポリオーマウイルスのエンハンサー配列を単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターと融合させたプロモーター。下流のマーカー遺伝子をユビキタスに発現させます。

マーカー: ジフテリア毒素A遺伝子。EF‐2の活性阻害によって細胞のアポトーシスを誘導することによるネガティブセレクションを可能にします。

BGH pA: ウシ成長ホルモンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。