PBトランスポゾン型 コンディショナルノックアウトベクター（Floxed）

概要

このPBトランスポゾン遺伝子ノックアウトベクターシステムは、哺乳類細胞および動物においてCreを介したコンディショナルノックアウトシステムを利用します。このFloxedシステムは、目的遺伝子の両端にLoxP組換え部位を配置し、Cre依存的にコーディング配列を欠失させることで遺伝子発現の不活化を誘導します。Creリコンビナーゼが存在しない場合、目的遺伝子の発現は維持されます。このベクターを保持する細胞にCreを導入すると、目的遺伝子は恒久的に切除されます。

本ベクターシステムは組織培養細胞でも使用できますが、特にトランスジェニック動物の作製に適しています。このようなベクターで作製したトランスジェニック動物を組織特異的にCreを発現する動物と交配させると、両方の導入遺伝子を保持する子孫動物において、組織特異的にCreを発現している細胞でのみ目的遺伝子がノックアウトされます。

PBトランスポゾン誘導性遺伝子発現システムは2種類のプラスミドベクター、トランスポゾンプラスミドとトランスポゼース（PBase）発現ヘルパープラスミドから構成されます。トランスポゾンプラスミドはTR（Terminal Repeat）のペアによって挟まれた転移領域を持ちます。テトラサイクリン応答因子（TRE）プロモーター下流で目的遺伝子を発現するテトラサイクリン誘導性遺伝子発現カセットはITRのあいだにクローニングされています。PBaseとPB shRNAランスポゾンプラスミドが目的細胞に同時にデリバリーされると、PBaseがトランスポゾンプラスミド上の両末端のITRを認識し、宿主ゲノム中のTTAA配列にITRと目的遺伝子を含む領域を組み込みます。トランスポゼース(PBase)は、1）一過的なヘルパープラスミドのトランスフェクションもしくは、２）IVT (in vitro transcribed) PBase mRNAを目的細胞へマイクロインジェクションする、2通りの方法でトランスポゾンを目的細胞にデリバリーできます。どちらの方法でも、トランスポゼースは短い間のみ発現します。ヘルパープラスミドの消失もしくはPBase mRNAの分解によってゲノムに挿入されたトランスポゾンは安定化します。

PBトランスポゾンは、カット＆ペースト型のクラスIIトランスポゾンに分類され、自己コピーを残さずに転移します（クラスIトランスポゾンは、コピー＆ペースト型で、自己コピーを残して転移します）。ヘルパープラスミドを再び導入することにより、ゲノムに痕跡を残すことなくPB shRNAランスポゾンを取り除くことができます。

細胞培養でこのベクターシステムを使用する場合、薬剤耐や蛍光色素遺伝子をマーカーとしてベクターに追加することで、ベクターがゲノムに恒久的に組み込まれた細胞の単離やトランスフェクションされた細胞の選択や可視化が可能になります。なお、本ベクター単独では2つのLoxP部位間の組み換えを起こすことはできません。ヘルパーベクターやCreをコードするmRNAなどを介したCreの共発現が必要です。

当ベクターシステムおよびCreを介した組換えに関する詳細な情報については、下記の文献を参照してください。

特長

このPB shRNAランスポゾンを用いたベクターは、哺乳類細胞および動物におけるCreを介したコンディショナルノックアウト用に設計されています。目的遺伝子の発現は、最初は選択したプロモーターの制御下で発現しますが、Creリコンビナーゼの共発現によって目的遺伝子をコードする領域を恒久的に切り出すことで、その発現を恒久的にサイレンシングできます。

メリット

安定した遺伝子不活性化:&nbspCreリコンビナーゼによる処理は、目的遺伝子をコードする配列を恒久的に除去し、その転写を阻害します。

ベクターDNAの恒久的な組み込み: 従来の方法で宿主細胞へ導入されたベクターDNAはほとんどが時間経過とともに失われます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。PB shRNAランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミド（トランスポゼース発現）を使用した遺伝子導入法ならば、トランスポゾンを利用したベクターDNAの宿主ゲノムへの挿入によって恒久的な目的遺伝子の導入が可能です。

技術的簡便性: トランスフェクション法によるプラスミドベクターの導入は、ウイルスパッケージングを必要とするウイルスベクターよりも、はるかに簡単な技術で行うことができます。

非常に大きな搭載容量: 当社のトランスポゾンベクターは～30kbのDNAを搭載することができます。ベクターバックボーン領域とトランスポゾン関連配列の3kbを差し引いても、目的遺伝子の挿入には十分なスペースが用意されています。

デメリット

限定的な細胞種の範囲: PBトランスポゾンベクターの細胞への導入はトランスフェクションに依存します。プラスミド導入の効率は細胞種によって大きく異なり、多くの場合は最適化が必要です。プライマリー（初代培養）細胞は不死化細胞株よりもトランスフェクションが困難であることが多く、一部の細胞種はトランスフェクションが極めて難しいことが知られています。

基本コンポーネント

PBトランスポゾン 5' ITR: 5' 逆向き末端反復配列（ITR: inverted terminal repeat）。PB shRNAランスポゼースが両末端のITRを認識し、ITRとITR間にデザインされたDNA領域を宿主ゲノムに挿入します。

Promoter: 目的遺伝子の発現を駆動するプロモーターをここに配置します。

LoxP: Creリコンビナーゼの組換え配列。Creが存在下で2つのLoxP配列間の領域が切り出されます。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置されます。

ORF: 目的遺伝子のオープンリーディングフレーム（Open reading frame）をここに配置します。

rBG pA: ウサギβ-グロビンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

CMV promoter: ヒトサイトメガロウイルス全初期遺伝子プロモーター。下流マーカー遺伝子の発現をユビキタスに駆動します。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）や視覚化用遺伝子（EGFPなど）、もしくはデュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にします。

BGH pA: ウシ成長ホルモンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

PBトランスポゾン 3' ITR: 3' 逆向き末端反復配列（ITR: inverted terminal repeat）。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。