piggyBac遺伝子発現ベクター

piggyBac遺伝子発現ベクターの概要

ベクタービルダーがカスタム構築するpiggyBacベクターシステムは、哺乳類細胞のゲノムに、デザインした外来DNAを効率的に組み込むことができます。このシステムはウイルスを使った遺伝子導入に比べて技術的に簡単で、プラスミドDNAのトランスフェクション方法で目的細胞のゲノムDNAに、発現させたい目的遺伝子を恒久的に組み込むことができます。

本システムは、キャベツルーパー(Trichoplusia ni, 蛾の一種)から単離されたpiggyBacトランスポゾンに由来しています。シークエンスの相同性より、piggyBacトランスポゾンは多くの動物において一般的なトランスポゾンの1クラスに属していることが明らかになっています。

PiggyBacシステムは2種類のプラスミドベクターから成り、ともに大腸菌で遺伝子改変が可能になっています。一方のプラスミドベクターは、トランスポゼースをコードする遺伝子をもつヘルパープラスミドで、PBaseとして広く知られています。他方のプラスミドベクターは、トランスポゾンベクターで、宿主細胞のゲノムDNAに転移させる目的遺伝子を含むフラグメントを、piggyBacの terminal repeats (TRs) で挟んだデザインになっています。

ヘルパープラスミドと独自にデザインしたトランスポゾンプラスミドを標的細胞にコトランスフェクトすると、ヘルパープラスミドから産生されたトランスポゼース(PBase)がトランスポゾンプラスミド上の両末端のTRを認識し、宿主ゲノム中のTTAA配列にTRと目的遺伝子を含む領域を組み込みます。

PiggyBacは、カット&ペースト型のクラスIIトランスポゾンに分類され、自己コピーを残さずに転移します(クラスIトランスポゾンは、コピー&ペースト型で、自己コピーを残して転移します)。ヘルパープラスミドは宿主細胞に一過的に導入されるだけなので、時間の経過とともに消失し、ヘルパープラスミドの消失により、宿主ゲノムへのトランスポゾンの組み込みが恒久的になります。ヘルパープラスミドを再び導入することにより、ゲノムに痕跡を残すことなくpiggyBacトランスポゾンを取り除くことができます。

本ベクターシステムの詳細については、以下の文献をご参照下さい。

文献 トピックス
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011) レビュー
Cell. 122:473 (2005) 哺乳細胞とマウスにおけるpiggyBacトランスポゾンの効率的な転移

piggyBac遺伝子発現ベクターの特徴

ベクタービルダーのpiggyBacトランスポゾン遺伝子発現ベクターと、トランスポゼースを供給するヘルパーベクター(PBase)は、共に高コピー数プラスミドDNAとしてデザインされ、大腸菌での大量増幅が可能です。また幅広い種類の目的細胞に対して、効果的なトランスフェクションが可能で、piggyBac遺伝子発現ベクター内にデザインされた遺伝子の高い発現レベルを維持します。

piggyBac遺伝子発現ベクターのメリット

ベクターDNAの恒久的な組み込み: 一般的なトランスフェクションでは、細胞への一過的なDNAの導入のため、ベクターDNAは時間とともに消失します。特に分裂速度の速い細胞では弱点となります。反対に、piggyBacトランスポゾンベクターを、トランスポゼースを供給するヘルパーベクターと共に細胞にトランスフェクトすることで、piggyBacベクターのITR間にデザインされた遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれます。そのため宿主細胞に恒久的な遺伝子導入を行うことが可能です。

技術的に簡単: トランスフェクション法によるプラスミドベクターの導入は、ウイルス生体へのパッケージングを必要とするウイルスベクターよりも、はるかに簡単な技術で行うことができます。

カーゴサイズが非常に大きい: ベクタービルダーのトランスポゾンベクターは~30kbのDNAを搭載することができます。ベクターバックボーン領域とトランスポゾン関連配列の3kbを差し引いても、目的遺伝子の挿入には十分なスペースが用意されています。

piggyBac遺伝子発現ベクターのデメリット

細胞タイプの制限: piggyBacベクターの細胞への導入はトランスフェクションに依存しますが、トランスフェクション効率は細胞タイプによって大きく異なります。非分裂細胞は分裂細胞よりも、また初代培養細胞はライン化された細胞よりも導入が困難です。さらに、神経細胞や膵臓β細胞などある種の細胞では、トランスフェクション法でのベクター導入は難しいことが知られています。また、プラスミドのトランスフェクションはin vitro実験に限定され、in vivo実験は一般的ではありません。

ベクタービルダーのpiggyBac遺伝子発現ベクターの基本コンポーネント

5' ITR: 5’末端逆向き反復配列。5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポザーゼが両末端のITRを認識し、ITRとITR間にデザインされたDNA領域を宿主ゲノムに挿入します。

Promoter: 目的遺伝子を発現させるためのプロモーターをここに配置します。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。

ORF: 目的遺伝子のOpen reading frameをここに配置します。

rBG pA: ウサギ β-グロビンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

CMV promoter: ヒトサイトメガロウイルス全初期遺伝子プロモーター。下流マーカー遺伝子の発現をユビキタスに促進します。

Marker: 薬剤耐性遺伝子 (例 ネオマイシン耐性遺伝子など)、可視化遺伝子(例 EGFPなど)、またはデュアルレポーター遺伝子(例 EGFP/Neoの共発現)マーカー遺伝子。マーカーによってベクター内の遺伝子導入の成功を薬剤選択または可視化にて選抜します。

BGH pA: ウシ成長ホルモンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

3' ITR: 3' 末端逆向き反復配列

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。