レンチウイルスU6型Tet誘導性shRNAノックダウンベクター

概要

VectorBuilderのレンチウイルスTet誘導型shRNAノックダウンベクターは、多様な哺乳類細胞株において標的遺伝子ノックダウンをオン/オフを制御しつつ高効率に実施可能なシステムであり、細胞の分化過程や細胞の生存に必須な遺伝子の研究に有効なツールとなります。このシステムは、テトラサイクリンまたはその類似体（例：ドキシサイクリン）の存在下または非存在下において、抑制因子（TetR）とオペレーター（TetO）タンパク質間の相互作用を利用してshRNA発現を調節します。

このベクターには、標的遺伝子（GOI）を標的とするshRNAの直上流に、2つのTetO要素（U6/2xTetO）を反復配列として持つ改変ヒトU6プロモーターが含まれており、テトラサイクリンまたはその類似体（例：ドキシサイクリン）の存在下でshRNAの発現を増強する機能を有します。これらの薬剤が存在しない場合、TetRはTetOに結合し、shRNAの転写を抑制します。逆に、テトラサイクリンまたはその類似体が存在すると、それがTetRに結合し、構造変化を引き起こします。これによりTetRはTetOに結合できなくなり、U6プロモーターによって駆動されるshRNAの転写が可能となります。

VectorBuilderは、一般的な生物種向けに最適化されたshRNAのデータベースを構築しました。shRNAの設計には RNAiコンソーシアムなどが採用する方法を適用しています。VectorBuilderのオンラインプラットフォームでshRNAベクターを設計する際、当社データベースから標的遺伝子を検索できるようになっています。遺伝子名を入力すると、目的遺伝子（GOI）に対して当社データベースで利用可能な全てのshRNAに関する詳細情報が表示されます。これには、ゲノム配列および全ての転写アイソフォームを確認できるUCSC Genome Browser のリンクも含まれています。当社のデータベースは、対象遺伝子に対して利用可能な全てのshRNAをノックダウンスコアの高い順にランク付けしており、ノックダウンスコアが最も高い上位3つのshRNAで検証することを推奨しています。

当社のレンチウイルスベクターはウイルスのパッケージングや感染に必要になる遺伝子群が取り除かれています。これらの遺伝子はウイルスパッケージングの際には、代わりにヘルパープラスミドで導入します。レンチウイルスベクターによって生産されるウイルスは複製不能（細胞に感染はできるが複製はできない）なため、安全性が保障されています。

本ベクターシステムの詳細については、以下の文献をご参照下さい。

特長

当社のレンチウイルスTet誘導型shRNAノックダウンベクターは、第3世代レンチウイルスベクターシステムを基盤としています。本システムは、大腸菌における高コピー数複製、高力価の生ウイルスパッケージング、広範な細胞タイプへの高効率な遺伝子導入、および宿主ゲノムへの挿入を実現できるように最適化されています。2つのTetO要素を有する改変ヒトU6プロモーターは、テトラサイクリンまたはその類似体（例：ドキシサイクリン）の存在下でのみ、哺乳類細胞において下流のshRNAを高レベルで転写します。当社のshRNAステムループ配列は、効率的なshRNA形成と標的遺伝子のノックダウンを可能にします。

実験による検証

当社のU6型Tet誘導性レンチウイルスshRNAノックダウンベクターは 図1 に示すように、ドキシサイクリン存在下における標的遺伝子の効率的なノックダウンが可能であることを検証済みです。

図1.レンチウイルスTet誘導性shRNAベクターシステムによるEGFPのノックダウン。(A) Tet誘導性U6型のスクラムブルまたはEGFPに対するshRNA発現カセットを有するレンチウイルスベクターをウイルスパッケージングし、EGFPを安定発現するHEK293T細胞に導入した。ピューロマイシンによる抗生物質選択を行い、選択された細胞群を1 µg/mlのドキシサイクリン（Dox）処理によりshRNA発現を誘導した。すべての実験群において、フローサイトメトリーを用いてEGFPの相対蛍光強度（RFI）を定量した。(B) 誘導型EGFP shRNA発現カセットをもつ細胞では、ドキシサイクリン誘導によりEGFP RFIが約60%減少した。一方、スクランブルshRNAを発現する誘導型shRNAベクターでは、ドキシサイクリン誘導によるEGFP RFIへの有意な影響は認められなかった。(C) 各群の代表的な蛍光顕微鏡画像を撮影した。露光時間：明視野＝10 ms；EGFP＝100 ms, 倍率：100x

メリット

ベクターDNAの恒久的な組み込み: レンチウイルスでは、ウイルスベクターが宿主ゲノムへ組み込まれるため、恒久的に遺伝子を導入することができます。そのため、テトラサイクリンやその類似体（例：ドキシサイクリン）によって、長期に渡り、遺伝子発現のオンオフスイッチを制御することができます。

厳密な制御と効率的な誘導: U6プロモーター内に存在する2つのTetO因子の反復配列により、テトラサイクリンまたはその類似体（例：ドキシサイクリン）の存在下でshRNAの発現が増強されます。

高ウイルスタイター: 当社のレンチウイルスベクターは非常に高いタイターのウイルスを作製できます（当社のウイルス作製サービスを利用すれば >10⁹ TU/mlが可能）。このレベルのタイターならば適量のウイルス上清を使うことで100％近い遺伝子導入効率が得られます。

非常に幅広い親和性: 当社のウイルスパッケージングシステムはVSV-Gエンベロープタンパク質をウイルス表面に追加してあるので幅広い親和性を実現しています。その結果、すべての一般的な哺乳類細胞といくつかの非哺乳類細胞への遺伝子導入が可能です。さらに、ほとんどの哺乳類細胞タイプ（増殖・非増殖細胞、プライマリ細胞、接着・非接着細胞）に遺伝子を導入することも可能です。レンチウイルスベクターはアデノウイルスベクター（いくつかの細胞タイプへの形質転換効率が低い）やMMLVレトロウイルスベクター（非増殖細胞の形質転換が困難）よりも広範な親和性を持つので、従来のトランスフェクション法では導入が難しかった神経細胞（Neuron）も当社のレンチウイルスベクターで比較的容易に遺伝子導入ができます。

均一な遺伝子導入: 一般的に、ウイルスによる導入は比較的バラツキが少なく、細胞間で均一にベクターを導入することができます。反対に、一般的なトランスフェクション法では、ある細胞では高コピー数、またある細胞では低コピー数あるいは全く導入されないなど、プラスミドベクターの導入は非常に不均一になります。

in vitroとin vivoで有効: レンチウイルスベクターは培養細胞（in vitro）と生体内（in vivo）の両方に対して効果的です。

安全性: 2つの工夫によって安全性を高めています。1つ目は、ウイルスパッケージングに必要な遺伝子を複数のヘルパープラスミドに分散させていることです。2つ目は、ウイルスベクターが宿主ゲノムへ組み込まれると、5‘LTRにあるプロモーター活性が不活化するようにデザインされていることです。パッケージングや導入の際に、複製能力を持ったウイルスが出現する可能性は限りなく低く、取り扱いにおいて安全に配慮したシステムになっています。

デメリット

技術的な複雑さ: レンチウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。一般的なプラスミドを使ったトランスフェクションと比べ、これら作業は高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

低効率: IPTG誘導性システムと比較するとノックダウン効率が低く、ダイナミックなノックダウンが見られにくい。

基本コンポーネント

CMVプロモーター: ヒト サイトメガロウイルス早期エンハンサー/プロモーター。パッケージング細胞内でのウイルスRNA転写を誘導し、ウイルスRNAは生ウイルス内にパッケージングされます。

5' LTR-ΔU3: HIVの5‘long terminal repeatの一部が欠失した配列です。野生型レンチウイルスの5' LTRと3' LTRのシークエンスは同じです。5' LTRと3' LTRは同方向でウイルスゲノムの両端に位置しています。ウイルス導入の際、3' LTRのシークエンスは5' LTRの上にコピーされます。野生型ウイルスでは、5' LTRはウイルスゲノムの転写を駆動するプロモーター、3' LTRは転写を終結させるためのポリＡ付加シグナルとして機能します。当社のレンチウイルスベクターの5' LTR-ΔU3は、ウイルス転写因子Tatによって促進されるLTRのプロモーター活性に必要な領域を欠失しています。プロモーター機能は5' LTR-ΔU3上流に配置したCMVプロモーターによって代替されるため、この欠失がウイルスRNA産生に影響を与えることはありません。

Ψ: ウイルスRNAをウイルスにパッケージングするために必要なHIV-1パッケージングシグナルです。

RRE: HIV-1 Rev response element　ウイルスパッゲージングにおいて、ウイルスRevタンパク質によるウイルスRNAの核外輸送を促進します。

cPPT: HIV-1 Central polypurine tract。感染細胞内でウイルスゲノムの核内輸送を促進させるためのDNAフラップを形成します。ベクターの宿主ゲノムへの挿入効率を上昇させ、形質転換効率を高めます。

U6/2xTetO: テトラサイクリンまたはそのアナログ（例：ドキシサイクリン）の存在下でshRNA発現を増強するために、テトラサイクリンオペレーター（TetO）配列の2つの繰り返しを有する、改変型ヒトU6 small nuclear 1プロモーター。テトラサイクリン抑制タンパク質（TetR）の存在下で、低分子調節因子なしに小分子RNAの発現が抑制されるPol IIIプロモーターです。

shRNA (Sense, Antisense): 標的配列から設計され、shRNAのヘアピン構造のステム部分を形成します。

shRNA (Loop): shRNAのヘアピン構造のループ部分を形成するために最適化された配列です。

Terminator: shRNAの転写を停止します。

hPGK+intron: ヒトphosphoglycerate kinase 1 (hPGK) プロモーターをウサギβグロブリンイントロン2のスプライシングシグナルと融合したもの。下流にあるORFのユビキタスな発現を駆動します。

Kozak: Kozakコンセンサスシークエンス。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。

調節タンパク質: テトラサイクリンリプレッサー（TetR）と、IRESリンカーによって連結した薬剤選択遺伝子（ピューロマイシン耐性遺伝子など）。細胞がTetRタンパク質を発現し、対応する薬剤に対する耐性を持つことを可能にします。テトラサイクリンまたはそのアナログ（例：ドキシサイクリン）が存在しない場合、TetRはTetOに結合し、下流の遺伝子または小分子RNAの転写を抑制します。テトラサイクリンまたはそのアナログが存在する場合、TetRはコンフォメーション変化を起こし、TetOに結合できなくなり、下流の遺伝子または小分子RNAの転写が可能になります。

WPRE: ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子。パッケージング細胞内でウイルスRNA安定化させ、ウイルス力価を向上させます。

3' LTR-ΔU3: HIV-1の3‘LTRのU3領域を欠損させた配列。ウイルスベクター挿入過程で3' LTRが5' LTRを上書きするために、プロモーター不活性型の5' LTR-ΔU3が宿主ゲノムへ挿入されます。3’LTR-ΔU3のポリAシグナルによって、ウイルスパッケージング中や宿主ゲノムへの組み込み後に産生される上流からの全ての転写が終結します。

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal　SV40初期ポリA付加シグナル。ウイルスパッケージング時の3' LTRによるウイルスRNA転写停止を補助します。パッケージング細胞でのウイルスRNAを増加させ高ウイルスタイターを実現します。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。