遺伝子ターゲッティング用ドナーベクター

概要

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9)ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます(同様にZFNやTALENなどもよく利用されます)。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA(gRNA)と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

Cas9の標的DNA配列切断によって生じるDSB(double-strand break)は2種類の経路(非相同性末端結合(nonhomologous end-joining pathway:NHEJ)と相同組み換え修復(homology-directed repair:HDR))によって修復されます。DSBは主にNHEJによって修復され、NHEJによるDSB修復は高頻度で小規模な配列欠損(稀に配列挿入及び塩基置換)を生じます。そのような変異が遺伝子のタンパク質翻訳領域で発生すると(欠損、挿入が原因となるフレームシフトによって)、遺伝子機能の破壊につながります。効率は低くなりますが、CRISPR/Cas9コンポーネントと外来性ドナーDNAテンプレートを同時に導入することによってHDRによるDSB修復も可能です。HDRによって標的ゲノムDNA配列はDNAテンプレート配列に組み換えられるため、点変異やDNA配列のノックインなど大幅な改変が可能になります。

当社の遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターを利用することで標的ゲノム配列にレポーター、蛍光タグ、その他の任意の配列を挿入するための外来性ドナーDNAテンプレートを効率的に構築できます。当ドナーベクターは任意の挿入配列の上流と下流に相同配列を組み込めるように設計されています。挿入予定配列の近傍(相同配列から10‐15bp以内にあることが理想)にDSBを作り出すことで効果的にHDRを起こすことができます。さらに、HDR用にドナーベクターを設計する場合にはCas9がHDR後のゲノムサイトを再切断してしまう可能性を排除するためにPAM配列を取り除く、もしくは改変してください

CRISPRターゲッティングの欠点のひとつは標的配列以外を切断してしまうオフターゲット活性ですので、オフターゲット活性スコアが最小になるように慎重にgRNA標的配列を選ぶ必要があります。hCas9をDSBでなく一本鎖切断(ニック)を作り出すように改変したニッケース変異体、hCas9-D10Aを使用することでオフターゲット活性をさらに減少させることができます。hCas9-D10Aニッケースを標的DNA配列のそれぞれのDNA鎖を標的とするふたつのgRNAとともに使用すると、一本鎖切断が二本鎖DNAのそれぞれの鎖に作り出されてDSBが標的配列に作り出されます。この方法は、両方のgRNAが同時に標的配列に結合することが必要になるために、CRISPR/Cas9におけるオフターゲット活性を減少させます。ニックの入ったゲノムDNAはHDRが起こりやすくなりますので、ドナーベクターに組み込まれた外来性ドナーDNAをhCas9-D10Aニッケースとともに導入すると希望するゲノム配列変換を起こすことができます。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Science. 339:819 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Biotechniques. 59:201 (2015) CRISPR/HDR-mediated knockin of large DNA fragments
Front Genet. 9:691 (2019) Methodologies for improving HDR efficiency
Cell. 154:1380 (2013) Use of Cas9 D10A double nicking for increased specificity

特徴

当社の遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターはCRISPRターゲッティングによって標的ゲノムサイトに作られたDSBを利用してHDRによる任意の配列(レポーター、蛍光タグまたはその他のDNA配列など)を挿入できるように設計されています。効果的なHDRのために上流と下流の相同配列のあいだに任意の挿入配列を組み込みます。相同配列の長さは挿入配列の長さに応じて調節してください。挿入配列が長いほど必要な相同配列の長さは大きくなります。

メリット

正確な改変:遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターとして外来性修復テンプレートを導入することで標的ゲノム配列にHDRによる正確な配列改変をおこなえます。

簡便さ:従来通りの遺伝子導入法をもちいて遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターをCas9と標的配列特異的なgRNAとともに哺乳類細胞に導入することでHDRによるゲノム編集を行います。パッケージングなどが必要なウイルスによる遺伝子導入と比べて、従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入は簡便です。

デメリット

細胞タイプが限定される:プラスミドベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。非増殖細胞は一般的に増殖細胞よりも効率が悪く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。プラスミドによる遺伝子導入はin vitro用途に限定され、in vivo用途にはほとんど使用されません。

効率の低さ:Cas9による標的配列切断後の修復はNHEJが主であり、HDRによる修復頻度は非常に低くなります。そのため、外来性ドナーDNAテンプレートをもちいたCRISPR/Cas9ターゲティングをおこなうと、NHEJ修復された細胞とHDR修復された細胞が混在している細胞集団が生じます。得られた細胞集団からHDRによる望みのゲノム編集を受けた細胞を慎重にスクリーニング、同定することが重要です。相同遺伝子座の両方に同様の遺伝子改変が必要な場合は、同じノックイン手順が必要になります。

PAM配列が必要:CRISPR/Cas9標的配列はgRNA認識配列の3‘末端直後にPAM配列として“NGG“が必要です。HDR用途にドナーベクターを設計する場合には、Cas9がHDR完了した後のゲノム配列を再切断してしまう可能性を排除するためにPAM配列を取り除くか改変してください。

基本コンポーネント

5’-Homology Arm: 挿入配列のすぐ上流の相同配列。配列の長さは挿入配列の長さに依存する。長い挿入配列ほど長い相同配列が必要。

Donor Sequence/Cassette: 標的ゲノムサイトにノックインする挿入配列。

3’-Homology Arm: 挿入配列のすぐ下流の相同配列。配列の長さは挿入配列の長さに依存する。長い挿入配列ほど長い相同配列が必要。

MC1 Promoter: ポリオーマウイルスのエンハンサー配列を単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターに融合させてある。下流のマーカー遺伝子を遍在的に発現する。

Marker: ジフテリア毒素A遺伝子。EF‐2の活性阻害によって細胞のアポトーシスを誘導することによるネガティブセレクションを可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。