アデノウイルス型 コンディショナルノックアウトベクター（Floxed）

概要

アデノウイルス型 コンディショナルノックアウトベクターは、VectorBuilderの高効率なアデノウイルスベクターシステムとCreを介したコンディショナルノックアウトシステムを組み合わせ、様々な哺乳類細胞種においてアデノウイルスを用いてCre依存的に遺伝子発現を不活化することを可能にします。このFloxedシステムは、目的遺伝子の両端にLoxP組換え部位を配置し、Cre依存的にコーディング配列を欠失させることで遺伝子発現の不活化を誘導します。Creリコンビナーゼが存在しない場合、目的遺伝子の発現は維持されます。このベクターを保持する細胞にCreを導入すると、目的遺伝子は恒久的に切除されます。

アデノウイルス型 コンディショナルノックアウトベクターは、まず大腸菌内で2つの逆向き末端反復配列（ITR）の間にLoxPで挟んだ目的遺伝子を配置したプラスミドとして構築されます。次に、複数のヘルパープラスミドとともにパッケージング細胞にトランスフェクションされ、生ウイルスを産生します。ウイルスを標的細胞に添加すると搭載されたDNAが細胞内に送り込まれ、核に移行して宿主ゲノムに組み込まれることなくエピソーマルDNAとして留まります。ベクター構築時に2つのITR間に配置されたFloxed遺伝子も他のウイルスゲノムとともに標的細胞に導入されます。その後、Creリコンビナーゼの存在下でCre依存的に目的遺伝子欠損を誘導し、遺伝子発現を不活化することができます。

アデノウイルスベクターはE1A, E1BおよびE3遺伝子を欠損させており (delta E1 + delta E3)、代わりにウイルス産生に必要なE1A,とE1Bはパッケージング細胞のゲノムに組み込まれています。このため、アデノウイルスベクターから産生されるウイルスは、細胞に導入されても複製はされず、安全に配慮されたシステムとなっています。なお、本ベクター単独では2つのLoxP部位間の組み換えを起こすことはできません。ヘルパーベクターやCreをコードするmRNAなどを介したCreの共発現が必要です。

当ベクターシステムおよびCreを介した組換えに関する詳細な情報については、下記の文献を参照してください。

特長

アデノウイルス型 コンディショナルノックアウトベクターは、哺乳類細胞および動物におけるCreを介して条件的に遺伝子欠損を実現するように設計されています。目的遺伝子の発現は、最初はユーザーが選択したプロモーターの制御下にありますが、Creリコンビナーゼの共発現によって目的遺伝子をコードする領域を恒久的に切り出すことで、その発現を恒久的にサイレンシングできます。本ベクターはアデノウイルスセロタイプ5（Ad5）に由来しています。生ウイルスの高タイターパッケージング、宿主細胞への効率的な形質導入、および高レベルの導入遺伝子発現のために最適化されています。

メリット

安定した遺伝子不活性化: Creリコンビナーゼによる処理は、目的遺伝子をコードする配列を恒久的に除去し、その転写を阻害します。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い: 標的細胞への形質導入後、アデノウイルスベクターは核内にエピソーマルDNAとして留まります。宿主ゲノムへ挿入されないことは、がんの原因となるような宿主ゲノムへのリスクを低減するため、ヒトへの応用において好ましい特徴となります。

非常に高いウイルスタイター: アデノウイルスベクターは、パッケージング細胞にトランスフェクションして生ウイルスを産生させると、産生されたウイルスが更にパッケージング細胞に再感染し、ウイルスが増幅されるため、非常に高い力価で回収することができます。これは、再感染による増幅が不可能なレンチウイルス、MMLVレトロウイルス、またはAAVとは異なる点です。当社のウイルスパッケージングサービスをご利用いただいた場合、タイターは10¹¹ infectious units/ml (IFU/ml) 以上に達することがあります。

幅広い指向性: ヒト、マウス、ラットなどの一般的な哺乳類種の細胞に導入可能ですが、一部の細胞種では導入が困難なことが判明しています（下記のデメリットを参照）。

大きな搭載容量: 効率的なウイルスパッケージングが可能なアデノウイルスゲノムのサイズ上限は、約38.7 kb（5' ITRから3' ITRまで）です。アデノウイルスの遺伝子発現とCre依存性の組換えに必要なバックボーンコンポーネントを除くと、目的のDNAのために約7.4 kbの搭載スペースを確保できます。これは当社のレンチウイルス型 コンディショナル遺伝子発現ベクターの約6.3 kbよりも大きく、ほとんどの用途において十分な容量です。

in vitroおよびin vivoでの有効性: 当社のベクターは、生体動物の細胞への形質導入によく使用されますが、in vitroでも効果的に使用できます。特に、Cre依存的コンディショナル遺伝子ノックアウトが可能なトランスジェニック動物の作製に適しています。

安全性: ウイルス産生に必須な遺伝子を欠損させ、安全性を高めています。（これらの遺伝子は、パッケージング細胞のゲノムに組み込まれています。）したがって、本ベクターから産生されたウイルスは、パッケージング細胞に導入される場合を除き、複製能を持ちません。

デメリット

ベクターDNAの非組み込み: アデノウイルスゲノムは、導入された細胞のゲノムには組み込まれません。エピソーマルDNAとして存在するため、時間の経過と共に消失するため、分裂細胞では特に消失されやすくなります。

特定の細胞種への形質導入の難しさ: アデノウイルスベクターは非分裂細胞を含め、多くの細胞種に導入可能ですが、内皮細胞、平滑筋、分化した気道上皮細胞、末梢血細胞、神経細胞、および造血細胞など、特定の細胞種への導入は難しいことが知られています。

強い免疫原性: アデノウイルスベクターから産生された生ウイルスは強い免疫反応を引き起こすため、in vivoでの使用用途には制限があります。

技術的複雑性: アデノウイルスベクターの使用には、パッケージング細胞での生ウイルスの製造とその後のウイルスタイターの測定が必要です。一連の作業は高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

基本コンポーネント

5' ITR: 5' 逆向き末端反復配列（ITR: inverted terminal repeat）。 野生型ウイルスでは5’ITRと3’ITRは同じ配列で、ウイルスゲノム両端に反対の方向で配置されており、ウイルスゲノムの複製起点になります。

Ψ: ウイルスDNAをウイルスへとパッケージングするために必要なアデノウイルスパッケージングシグナルです。

Promoter: 目的遺伝子を駆動するプロモーターをここに配置します。

LoxP: Creリコンビナーゼの組換え配列。Creが存在下で2つのLoxP配列間の領域が切り出されます。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核生物における翻訳開始を促進すると考えられているため、ORFの開始コドンの直前に配置されます。

ORF: 目的遺伝子のオープンリーディングフレーム（Open reading frame）をここに配置します。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）や視覚化用遺伝子（EGFPなど）、もしくはデュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にします。

TK pA: 単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Herpes simplex virus thymidine kinase）ポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

ΔAd5: 2つのITR間のAd5ゲノム領域から、E1A、E1BおよびE3領域を除いたもの。

3' ITR: 3' 逆向き末端反復配列（ITR: inverted terminal repeat）。

PacI: PacI 制限酵素部位（PacIは低頻度切断酵素で、TTAATTAAを切断します）。ベクター上の2つのPacI制限酵素部位は、効率よいパッケージングのために、ベクターを線状化し、ウイルスシークエンスからベクターバックボーンを取り除くために使用されます。

pBR322 ori: pBR322の複製起点であるpBR322 oriをコードするプラスミドは、大腸菌では中程度のコピー数で保持されます。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。