アデノウイルス遺伝子発現ベクター

アデノウイルスベクターの概要

アデノウイルスベクターシステムでは様々な哺乳細胞種へ遺伝子を導入することができます。導入細胞では、ベクターは宿主ゲノムに組み込まれることなく、エピソーマルDNAとして存在します。遺伝子治療やワクチン接種によく使用され、in vivo実験で推奨される遺伝子導入システムです。

アデノウイルスベクターは風邪(感冒)の原因となるアデノウイルスに由来しています。野生型アデノウイルスは2本鎖線状DNAゲノムを有しています。

アデノウイルスベクターは、まず、大腸菌プラスミドとして構築し、その後、パッケージング細胞へトランスフェクトします。パッケージング細胞では、2つのLong terminal repeats (LTR)間にコードされたベクターDNAがウイルスにパッケージングされます。

ターゲット細胞内に運ばれたウイルスDNAは、核へと移行し宿主ゲノムへランダムに組み込まれることなく、エピソーマルDNAとしてとどまります。ベクター構築時に、2つのLTR間に挿入された遺伝子は、残りのウイルスゲノムと共にターゲット細胞に導入されます。

アデノウイルスベクターはE1A, E1BおよびE3遺伝子 (delta E1 + delta E3)を欠損し、代わりにウイルス産生に必要なE1A,とE1Bはパッケージング細胞のゲノムに組み込まれています。このため、アデノウイルスベクターから産生されるウイルスは、細胞に導入されても複製はされず、安全に配慮されたシステムとなっています。

本ベクターシステムの詳細については、以下の文献をご参照下さい。

文献 トピックス
Proc Natl Acad Sci U S A. 91:8802 (1994) 第2世代アデノウイルスベクター
J Gen Virol. 36:59 (1977) アデノウイルスベクターのパッケージング細胞株
J Virol. 79:5437 (2005) 293細胞におけるReplication-competent adenovirus (RCA)
Gene Ther. 3:75 (1996) RCAテスト用細胞株

アデノウイルスベクターの特徴

アデノウイルスセロタイプ5(Ad5)由来のベクターで、大腸菌では高コピー数で複製されます。高力価ウイルスパッケージングが可能で、また、宿主細胞へのウイルス導入効率にも優れ、トランスジーンを高レベルで発現することができます。

アデノウイルスベクターのメリット

宿主ゲノムを破壊しない: 宿主細胞へ導入されたアデノウイルスベクターは、核内でエピソーマルDNAとしてとどまります。宿主ゲノムへ組み込まれないことは、ヒトへの応用には望ましく、ゲノム破壊によって引き起こされる発がんリスクを抑えることができます。

非常に高いウイルスタイター: ウイルス産生のため、パッケージング細胞にアデノウイルスベクターをトランスフェクトすると、産生されたウイルスが更にパッケージング細胞に再感染し、ウイルスが増幅されるため、非常に高い力価で回収することができます。これは、再感染によって増幅できないMMLVレトロウイルスやAAVとは異なる特徴です。ベクタビルダーのパッケージングサービスでは、10^9 plaque-forming unit(PFU/ml)以上の力価でウイルスを回収することができます。

幅広い組織指向性: ヒト、マウス、およびラットなどの一般的に使用される哺乳動物種の細胞に導入することができますが、ある種の細胞には難しいことが知られています。

大きなカーゴスペース: 効率よくウイルスパッケージングを行うための、アデノウイルスゲノムサイズの上限は、~38.7kb(5’ITRから3’ITRまで)です。アデノウイルス遺伝子の発現に必要なベクターバックボーンのコンポーネント分を差し引くと、搭載スペースは~7.5kb(プロモーター、ORF、蛍光マーカーなど)になります。搭載スペースが~6.4kbしかないレンチウイルスベクターに比べ、ほとんどの使用目的において十分な大きさです。

In vitroとin vivoでの使用: 動物生体でよく使用されますが、in vitroでも効率よく導入することができます。

安全への配慮: ウイルス産生に必須な遺伝子を欠損させ、安全性を高めています。(これらの遺伝子は、パッケージング細胞のゲノム上に組み込まれています。)ベクタビルダーのベクターから産生されたウイルスは、パッケージング細胞へ導入はできますが、複製はされません。

アデノウイルスベクターのデメリット

ベクターDNAの組み込みがない : アデノウイルスゲノムは導入細胞のゲノムには組み込まれません。エピソーマルDNAとして存在し、時間の経過と共に消失するため、分裂細胞では特に消失されやすくなります。 

導入細胞の制限: 非分裂細胞を含め、様々なタイプの細胞へ導入が可能ですが、内皮、平滑筋、気管上皮、末梢血、神経、および造血など、ある種の細胞への導入は難しいことが知られています。

強い免疫原性: 強い免疫反応を引き起こすため、in vivoでの使用用途には制限があります。

技術的な難しさ: アデノウイルスベクターの使用では、パッケージング細胞で生きたウイルスを作製し、ウイルス力価を測定する必要があります。これらの作業は、一般的なプラスミドのトランスフェクションに比べ、技術が必要で、時間もかかります。

ベクタービルダーのアデノウイルスプラスミドベクターの基本コンポーネント

5' ITR: 5'  inverted terminal repeat. 野生型ウイルスでは5’ITRと3’ITRは同じ配列で、ウイルスゲノム両端に反対の方向で配置されており、ウイルスゲノムの複製起点になります。

Ψ: ウイルスDNAをウイルスにパッケージングするために必要なアデノウイルスパッケージングシグナルです。

Promoter: 目的遺伝子を駆動するプロモーターをここに配置します。

Kozak:Kozak共通配列。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。

ORF: 目的遺伝子のOpen reading frameをここに配置します。

BGH pA: ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ付加シグナル。パッケージングにおいて、上流ORFのRNA転写を終結させます。

hPGK promoter: ヒト phosphoglycerate kinase 1遺伝子のプロモーター。下流マーカー遺伝子のユビキタスな発現を行います。 

Marker: 可視遺伝子産物 (例 EGFP). ウイルスベクターが導入された細胞の選択と可視化が可能になります。

TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase ポリA付加シグナル。パッケージングにおいて、上流ORFのRNA転写を終結させます。

ΔAd5: E1A, E1BおよびE3領域を除いた、2つのITR間にあるAd5のゲノム領域。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

pBR322 ori: pBR322の複製起点であるpBR322 oriをコードするプラスミドは、大腸菌では中程度のコピー数で保持されます。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

PacI: PacI 制限酵素部位(PacIは低頻度切断酵素で、TTAATTAAを切断します)。ベクター上の2つのPacI制限酵素部位は、効率よいパッケージングのために、ベクターを線状化し、ウイルスシークエンスからベクターバックボーンを取り除くために使用されます。

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