AAV型 コンディショナルノックアウトベクター（Floxed）

概要

AAV型 コンディショナルノックアウトベクターは、VectorBuilderの汎用性の高いAAVベクターシステムとCreを介したコンディショナノックアウトシステムを組み合わせ、AAVを用いてin vitroおよびin vivoでCre依存的に遺伝子発現を不活化することを可能にします。このFloxedシステムは、目的遺伝子の両端にLoxP組換え部位を配置し、Cre依存的にコーディング配列を欠失させることで遺伝子発現の不活化を誘導します。Creリコンビナーゼが存在しない場合、目的遺伝子の発現は維持されます。このベクターを保持する細胞にCreを導入すると、目的遺伝子は恒久的に切除されます。

AAVベクターは、まず大腸菌内でプラスミドとして構築されます。その際、2つの逆向き末端反復配列（ITR）の間に、LoxPで挟んだ目的遺伝子をクローニングします。次に、ヘルパープラスミドとともにパッケージング細胞にトランスフェクションされ、2つのITRに挟まれた領域が生ウイルスにパッケージングされます。AAVウイルスを標的細胞に添加後、Creリコンビナーゼの存在下でコーディング配列がCre依存的に切り出され、遺伝子発現を不活化することができます。

AAV野生株のゲノムはssAAVと呼ばれる線状の一本鎖DNA（ssDNA）であり、両端にヘアピン構造を持つITRを持ちます。ssAAV上の遺伝子が発現するためにはまず、2つの経路によって二本鎖DNAに変換される必要があります。1）DNAポリメラーゼがssDNAゲノムをテンプレート、3' ITRを複製開始サイトとして相補鎖を複製する。2）ssAAVゲノムのあいだで＋鎖と－鎖のあいだの分子間ハイブリダイゼーションによって2本鎖DNAを作り出す。二本鎖DNAへの変換は主に1）の経路によってなされます。

AAVゲノムDNAは宿主細胞の核内で連結した（コンカテマー）エピソームDNAとして維持されます。エピソームDNAは宿主ゲノム内で複製されないので、AAVゲノムは非増殖細胞では宿主細胞内で維持されますが、増殖細胞では細胞分裂によって希釈されて最終的には消失します。AAVゲノムが宿主ゲノムに挿入されることは非常に稀です。それゆえベクターの挿入によって細胞が癌化する懸念がないのでAAVベクターは遺伝子治療などの用途に適しています。

AAVの最も大きな利点はバイオセーフティレベル１（BSL1）の実験室で扱えることです。 これはAVVが宿主細胞内で複製不能であり、ヒトに対して炎症反応や疾患の原因にほとんどならないためで、非常に実用性が高いシステムです。AAVは宿主生体内での免疫原性が低く、様々な動物実験に理想的なウイルスベクターです。

AAVは多くの系統が同定されており、ウイルスの表面タンパク質（カプシドタンパク質）の抗原性の違い（血清型またはセロタイプ）により型が分類されています。血清型の違いにより、組織指向性（組織別感染効率）が異なります。AAVベクターをウイルス粒子にパッケージングする際はその組織指向性を考慮して使用するウイルスの血清型を選ぶ必要があります。クローニングの際、特異性に影響を与えないためにこの分野では一般的であるAAV2由来のITRが使用されています。パッケージング用のヘルパープラスミドにはRep/Capプラスミドがあり、AAV2由来の複製遺伝子と選択した血清型のカプシドタンパク質を含み、指向性を決定します。以下の表はAAV血清型と適した標的組織・細胞のリストです。

なお、本ベクター単独では2つのLoxP部位間の組み換えを起こすことはできません。ヘルパーベクターやCreをコードするmRNAなどを介したCreの共発現が必要です。当ベクターシステムおよびCreを介した組換えに関する詳細な情報については、下記の文献を参照してください。

特長

AAV型 コンディショナルノックアウトベクターは、哺乳類細胞および動物におけるCreを介して条件的に遺伝子欠損を実現するように設計されています。目的遺伝子の発現は、最初はユーザーが選択したプロモーターの制御下にありますが、Creリコンビナーゼの共発現によって目的遺伝子をコードする領域を恒久的に切り出すことで、その発現を恒久的にサイレンシングできます。本ベクターは、大腸菌での高コピー数複製、生ウイルスの高タイターパッケージング、宿主細胞への効率的な形質導入、および高レベルの導入遺伝子発現のために最適化されています。このAAVウイルスベクターは、既知のすべてのカプシドセロタイプを用いてパッケージング可能であり、非常に高い形質導入効率を実現し、安全性リスクも低くなっています。

メリット

安定した遺伝子不活性化: Creリコンビナーゼによる処理は、目的遺伝子をコードする配列を恒久的に除去し、その転写を阻害します。

安全性: AAVは複製不能であり、ヒトの疾患の原因とならないので、最も安全なウイルスベクターシステムです。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い: 宿主細胞への導入後、AAVベクターはエピソームDNAとして細胞核に存在します。宿主ゲノムへの挿入が起こらないので癌化の原因となりうる宿主ゲノムの損傷リスクを減らすことができ、ヒトへのin vivo用途に適しています。

高ウイルスタイター: 当社のAAVベクターは、高タイターのウイルスにパッケージング可能です。当社のウイルスパッケージングサービスをご利用いただいた場合、タイターは10¹³ genome copy/ml (GC/ml) 以上に達することがあります。

幅広い指向性: 適切な血清型でウイルスを作製することによってヒト、マウス、ラットなど一般的に使用される哺乳類動物由来の幅広い細胞及び組織に遺伝子を導入できます。ただし、血清型によっては遺伝子導入が難しい細胞があります（下記のデメリットを参照）。

in vitroおよびin vivoでの有効性: 当社のベクターは、生体動物の細胞への形質導入によく使用されますが、in vitroでも効果的に使用できます。特に、Cre依存的コンディショナル遺伝子ノックアウトが可能なトランスジェニック動物の作製に適しています。

デメリット

小さな搭載容量: AAVは当社のウイルスベクターの中で、搭載できるウイルスゲノムサイズが最小です。AAVが許容できるITR間の最大サイズは4.7kbのため、ユーザーが選択できる遺伝子やコンポーネントの合計サイズは~4.1 kbに制限されます。

特定の細胞タイプへの形質導入の難しさ: AVVベクターは適切な血清型を選択することで非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能になります。それぞれの血清型は異なる組織親和性がありますが、どの血清型を使っても遺伝子導入が難しい細胞タイプも存在します。

技術的複雑性: AVVベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

基本コンポーネント

5' ITR: 5' 逆向き末端反復配列（ITR: inverted terminal repeat）。野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持ち、ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能します。

Promoter: 目的遺伝子を駆動するプロモーターをここに配置します。

LoxP: Creリコンビナーゼの組換え配列。Creが存在下で2つのLoxP配列間の領域が切り出されます。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核生物における翻訳開始を促進すると考えられているため、ORFの開始コドンの直前に配置されます。

ORF: 目的遺伝子のオープンリーディングフレーム（Open reading frame）をここに配置します。

Regulatory element: ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（WPRE：Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）を追加できます。WPREはパッケージング細胞におけるウイルスの安定性を高め、パッケージングされたウイルスのタイターを向上させるとともに、導入遺伝子の発現レベルを高めます。

BGH pA: ウシ成長ホルモンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

3' ITR: 3' 逆向き末端反復配列。5' ITRの説明を参照してください。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。