アデノ随伴ウイルスベクター: ssAAV
アデノ随伴ウイルス(single-stranded AAV, ssAAV)の概要
アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus, AAV)ベクターシステムは、in vitroおよびin vivoの遺伝子導入に広く利用されています。AAVは様々なタイプの哺乳細胞で使用することができますが、アデノウイルスとは異なり免疫原性が低く、またin vivoでの病原性が認められていないため、動物を使用する研究に適しています。
AAVウイルスベクターの作成は、まず大腸菌プラスミドとして構築し、その後、ウイルス粒子を作成するための複数のプラスミドDNAと共にパッケージング細胞(=ウイルス産生細胞)へトランスフェクトします。パッケージング細胞から産生されるウイルス粒子は、ヘアピン構造をとる両末端の5' と3' のLong terminal repeats (LTR)に挟まれた1本鎖ウイルスDNA(single-stranded AAV, ssAAV)をパッケージしています。
AAVウイルスを目的の細胞(ターゲット細胞)に感染させると、ウイルスは1本鎖ウイルスDNAをターゲット細胞内に運びます。そこではターゲット細胞のDNAポリメレースを使って、2本鎖ウイルスDNAに複製されます。これらの2本鎖ウイルスDNAは、ターゲット細胞の核でエピソーマルコンカテマーを形成します。非分裂細胞では2本鎖ウイルスDNAはその宿主細胞が生存する限り存在し続けます。反対に分裂細胞では、エピソーマルDNAは複製されないため、細胞分裂のたびに薄まってしまい、次第に効果が消失します。AAVではウイルスDNAが、宿主細胞のゲノムDNAにランダムにインテグレーションされることは極めてまれです。これはAAVを遺伝子治療ベクターとして用いる利点です。なぜなら、他のウイルスベクターではホスト細胞のゲノムDNAへのインテグレーションに起因する発ガン性が大きな懸念となっているからです。
AAVの実用面での大きなメリットは、バイオセイフティーレベル1(BSL1)の施設で取り扱いができることです。これは、AAVが本質的に複製能を欠如し、ほとんどあるいは全く炎症作用をもたず、また人に病気を引き起こすことはないと言われているためです。
自然界において多くのAAV種が同定されていますが、これらは、ウイルス表面のキャプシッドタンパク質の抗原性に基づき、異なる血清型に分類されています。セロタイプ(血清型)によってウイルスの組織指向性(感染の組織特異性)が異なります。AAVベクターをウイルスにパッケージングする際に、異なるキャプシッドタンパク質を使用することにより、異なる血清型をウイルスに付与することができます。以下の表にAAV血清型と組織指向性を表します。
血清型 |
指向組織(組織名をクリックすると参考論文にリンクします) |
AAV1 |
Smooth muscle, CNS, lung, retina, inner ear, pancreas, heart, liver |
AAV2 |
Smooth muscle, CNS, liver, kidney, retina, inner ear |
AAV3 |
Smooth muscle, liver, lung |
AAV4 |
CNS, retina, lung, kidney |
AAV5 |
Smooth muscle, CNS, lung, retina |
AAV6 |
Smooth muscle, heart, lung, adipose, liver |
AAV6.2 |
Lung, liver, inner ear |
AAV7 |
Smooth muscle, retina, CNS, liver |
AAV8 |
Smooth muscle, CNS, retina, inner ear, liver, pancreas, heart, kidney, adipose |
AAV9 |
Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, inner ear, testes, kidney |
AAVrh10 |
Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney |
AAV-DJ |
Liver, heart, kidney, spleen |
AAV-DJ/8 |
Liver, brain, spleen |
AAV-PHP.eB |
CNS |
AAV-PHP.S |
PNS |
AAV2-retro |
Spinal nerves |
AAV2-QuadYF |
Endothelial cell |
AAV2.7m8 |
Retina, inner ear |
組織名 |
推薦するAAV血清型(血清型をクリックすると参考論文にリンクします) |
Smooth muscle |
AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
CNS |
AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB |
PNS |
AAV-PHP.S |
Brain |
AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8 |
Retina |
AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2.7m8 |
Inner ear |
AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8 |
Lung |
AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10 |
Liver |
AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
Pancreas |
AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
Heart |
AAV1,AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ |
Kidney |
AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
Adipose |
AAV6, AAV8, AAV9 |
Testes |
AAV2, AAV9 |
Spleen |
AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
Spinal nerves |
AAV2-retro |
Endothelial cells |
AAV2-QuadYF |
本ベクターシステムの詳細については、以下の文献をご参照下さい。
ベクタービルダーのAAVベクターシステムは、大腸菌での高コピー数複製、生きたウイルスの高力価パッケージング、宿主細胞の効率的な形質導入、および高レベルの導入遺伝子発現を実現できるよう製造プロトコールを最適化しています。そのため、当社のAAVプラスミドベクターは、血清型として既知のキャプシッドを外套したウイルス粒子にパッケージした非常に高い形質導入効率をもち、かつ安全性に対するリスクが低いウイルスベクターです。
安全性: AAVは研究利用されるウイルスの中で、最も安全なウイルスベクターシステムです。本質的に複製能を欠如しており、人への病原性は認められていません。
宿主細胞のゲノム破壊の低リスク: 宿主細胞へ導入されたアデノウイルスベクターは、核内でエピソーマルDNAとしてとどまります。宿主ゲノムへの組み込まれないため、ヒトでの応用に望ましく、ゲノム破壊によって生じる発がんリスクを抑えることができます。
高いウイルスタイター: ベクタービルダーのssAAVベクターは、高タイターのパッケージングプロトコールを開発し使ってています。そのため、ベクタービルダーのウイルス作製サービスでは、10^13 genome copy/ml(GC/ml)以上のタイターでウイルスを回収することができます。
広範な組織指向性: 適切な血清型にパッケージングされれば、ヒト、マウス、およびラットなどの一般的に使用される哺乳動物種の様々なタイプの細胞および組織に導入することができます。しかしながら、使用する血清型によっては、ある種の細胞への導入は難しいことが知られています。(以下のデメリットを参照ください。 )
in vitro と in vivoでの両方で使用が可能: AAVは主に生きた動物へ形質導入する場合に使用されますが、in vitroにも効率よく使用できます。
搭載ゲノムサイズが小さい: AAVはベクタービルダーのウイルスベクターの中で、搭載できるウイルスゲノムサイズが最小です。AAVが許容できるITR間の最大サイズは4.7kbのため、ユーザーが選択できる遺伝子やコンポーネントの合計サイズは~4.2 kbに制限されます。
全ての種類の細胞に遺伝子導入できるわけではない: 適切な血清型にパッケージングされれば、非分裂細胞を含め、様々なタイプの細胞への遺伝子導入が可能ですが、細胞によっては、いずれの血清型を使用しても遺伝子導入が難しい場合があります。
技術的な難しさ: AAVウイルスベクターの使用には、ウイルス産生細胞に複数のプラスミドDNAをトランスフェクトして、生きたウイルス粒子を作成さえ、精製し、ウイルスのタイターを測定するなど、形質導入までにこなさなければならない様々な作業があります。これらの作業は、一般的なプラスミドのトランスフェクション法に比べ、技術的に習熟するまでの期間や、さらに実際のウイルス作製日数も長くかかります。
ベクタービルダーのssAAVプラスミドベクターの基本コンポーネント
5' ITR: 5’ inverted terminal repeat. 野生型ウイルスでは5’ITRと3’ITRは同じ配列で、ウイルスゲノム両端に反対の方向で配置されており、ウイルスゲノムの複製起点になります。
Promoter: 目的遺伝子を駆動するプロモーターをここに配置します。
Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。
ORF: 目的遺伝子のOpen reading frameをここに配置します。
Regulatory element: ユーザー判断でここに ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントWoodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE)を挿入できます。 WPRE はウイルス産生細胞でのウイルスの安定性をエンハンスします。そのため、ウイルス粒子の高いタイターとトランスジーンの高い発現を可能にします。
BGH pA: ウシ成長ホルモンポリA付加シグナル。パッケージングにおいて、上流ORFの転写を終結させます。
3' ITR: 3’ inverted terminal repeat. 5’UTRの項目を参照下さい。
Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。
pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。
デザインリクエストを送る
ベクタービルダーにベクターデザインと見積もりの両方を依頼する場合。その他のカスタム受託サービスのお見積りもここからお問い合わせください。