Adeno-associated Virus Gene Expression Vector

Overview

The adeno-associated virus (AAV) vector system is a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. AAV is effective in transducing many mammalian cell types, and, unlike adenovirus, has very low immunogenicity, being almost entirely nonpathogenic in vivo. This makes AAV the ideal viral vector system for many animal studies.

An AAV vector is first constructed as a plasmid in E. coli. It is then transfected into packaging cells along with helper plasmids, where the region of the vector between the two inverted terminal repeats (ITRs) is packaged into live virus. Any gene(s) placed in-between the two ITRs are introduced into target cells along with the rest of viral genome.

When AAV virus is added to target cells, the single-stranded linear DNA genome is delivered into cells, where it is converted by the host cell DNA polymerase machinery into double-stranded DNA. AAV vector DNA forms episomal concatemers in the host cell nucleus. In non-dividing cells, these concatemers can remain for the life of the host cells. In dividing cells, AAV DNA is lost through the dilution effect of cell division, because the episomal DNA does not replicate alongside host cell DNA. Random integration of AAV DNA into the host genome can occur but is extremely rare. This is desirable in many gene therapy settings where the potential oncogenic effect of vector integration can pose a significant concern.

A major practical advantage of AAV is that in most cases AAV can be handled in biosafety level 1 (BSL1) facilities. This is due to AAV being inherently replication-deficient, producing little or no inflammation, and causing no known human disease.

Many strains of AAV have been identified in nature. They are divided into different serotypes based on different antigenicity of the capsid protein on the viral surface. Different serotypes can render the virus with different tissue tropism (i.e. tissue specificity of infection). When our AAV vectors are packaged into virus, different serotypes can be conferred to the virus by using different capsid proteins for the packaging. The table below lists different AAV serotypes and their tissue tropism.

セロタイプ別
組織別

Serotype Tissue tropism
AAV1 Smooth muscle, skeletal muscle, CNS, lung, retina, inner earpancreas, heart, liver
AAV2 Smooth muscle, CNS, liver, kidney, retina, inner ear
AAV3 Smooth muscle, liver, lung
AAV4 CNS, retina, lung, kidney
AAV5 Smooth muscle, CNS, lung, retina
AAV6 Smooth muscle, heart, lung, adipose, liver
AAV6.2 Lung, liver, inner ear
AAV7 Smooth muscle, retina, CNS, liver
AAV8 Smooth muscle, CNS, retina, inner earliver, pancreas, heart, kidney, adipose
AAV9 Smooth muscle, skeletal muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, inner ear, testes, kidney
AAVrh10 Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney
AAV-DJ Liver, heart, kidney, spleen
AAV-DJ/8 Liver, brain, spleen
AAV-PHP.eB CNS
AAV-PHP.S PNS
AAV2-retro Spinal nerves 
AAV2-QuadYF Endothelial cell
AAV2.7m8 Retina, inner ear

Tissue type Recommended AAV serotypes
Smooth muscle AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10
Skeletal muscle AAV1, AAV9
CNS AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB
PNS AAV-PHP.S
Brain AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8
Retina AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2.7m8
Inner ear AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8
Lung AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10
Liver AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
Pancreas AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10
Heart AAV1,AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ
Kidney AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
Adipose AAV6, AAV8, AAV9
Testes AAV2, AAV9
Spleen AAV-DJ, AAV-DJ/8
Spinal nerves AAV2-retro
Endothelial cells AAV2-QuadYF

For further information about this vector system, please refer to the papers below.

References Topic
Methods in Enzy. 507:229-54 (2012) Review of AAV virology and uses
Curr Opin Pharmacol. 24:59-67 (2015) AAV use in gene therapy, and serotype differences

アデノ随伴ウイルス(ssAAV)の特徴

ベクタービルダーのAAVベクターシステムは、大腸菌での高コピー数複製、生きたウイルスの高力価パッケージング、宿主細胞の効率的な形質導入、および高レベルの導入遺伝子発現を実現できるよう製造プロトコールを最適化しています。そのため、当社のAAVプラスミドベクターは、血清型として既知のキャプシッドを外套したウイルス粒子にパッケージした非常に高い形質導入効率をもち、かつ安全性に対するリスクが低いウイルスベクターです。  

アデノ随伴ウイルス(ssAAV)のメリット

安全性: AAVは研究利用されるウイルスの中で、最も安全なウイルスベクターシステムです。本質的に複製能を欠如しており、人への病原性は認められていません。

宿主細胞のゲノム破壊の低リスク: 宿主細胞へ導入されたアデノウイルスベクターは、核内でエピソーマルDNAとしてとどまります。宿主ゲノムへの組み込まれないため、ヒトでの応用に望ましく、ゲノム破壊によって生じる発がんリスクを抑えることができます。

高いウイルスタイター: ベクタービルダーのssAAVベクターは、高タイターのパッケージングプロトコールを開発し使ってています。そのため、ベクタービルダーのウイルス作製サービスでは、10^13 genome copy/ml(GC/ml)以上のタイターでウイルスを回収することができます。

広範な組織指向性: 適切な血清型にパッケージングされれば、ヒト、マウス、およびラットなどの一般的に使用される哺乳動物種の様々なタイプの細胞および組織に導入することができます。しかしながら、使用する血清型によっては、ある種の細胞への導入は難しいことが知られています。(以下のデメリットを参照ください。 )

 in vitro と in vivoでの両方で使用が可能: AAVは主に生きた動物へ形質導入する場合に使用されますが、in vitroにも効率よく使用できます。

アデノ随伴ウイルス(ssAAV)のデメリット

搭載ゲノムサイズが小さい: AAVはベクタービルダーのウイルスベクターの中で、搭載できるウイルスゲノムサイズが最小です。AAVが許容できるITR間の最大サイズは4.7kbのため、ユーザーが選択できる遺伝子やコンポーネントの合計サイズは~4.2 kbに制限されます。

全ての種類の細胞に遺伝子導入できるわけではない: 適切な血清型にパッケージングされれば、非分裂細胞を含め、様々なタイプの細胞への遺伝子導入が可能ですが、細胞によっては、いずれの血清型を使用しても遺伝子導入が難しい場合があります。

技術的な難しさ: AAVウイルスベクターの使用には、ウイルス産生細胞に複数のプラスミドDNAをトランスフェクトして、生きたウイルス粒子を作成さえ、精製し、ウイルスのタイターを測定するなど、形質導入までにこなさなければならない様々な作業があります。これらの作業は、一般的なプラスミドのトランスフェクション法に比べ、技術的に習熟するまでの期間や、さらに実際のウイルス作製日数も長くかかります。

ベクタービルダーのssAAVプラスミドベクターの基本コンポーネント

5' ITR: 5’ inverted terminal repeat. 野生型ウイルスでは5’ITRと3’ITRは同じ配列で、ウイルスゲノム両端に反対の方向で配置されており、ウイルスゲノムの複製起点になります。

Promoter: 目的遺伝子を駆動するプロモーターをここに配置します。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。 

ORF: 目的遺伝子のOpen reading frameをここに配置します。

Regulatory element: ユーザー判断でここに ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントWoodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE)を挿入できます。 WPRE はウイルス産生細胞でのウイルスの安定性をエンハンスします。そのため、ウイルス粒子の高いタイターとトランスジーンの高い発現を可能にします。

BGH pA: ウシ成長ホルモンポリA付加シグナル。パッケージングにおいて、上流ORFの転写を終結させます。

3' ITR: 3’ inverted terminal repeat. 5’UTRの項目を参照下さい。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。