AAV gRNA発現ベクター

概要

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます（同様にZFNやTALENなどもよく利用されます）。

Cas9は、RNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原核生物の自然免疫システムの一部です。細胞内で、Cas9は18～22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA（gRNA）と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

CRISPRによる遺伝子ターゲティングには、標的配列特異的なgRNAとCas9が細胞内で共発現させる必要があります。Cas9とgRNAをひとつのベクター（all-in-oneベクター）から発現させるか、Cas9とgRNAをそれぞれ独立したベクターから発現させることによって共発現させることが可能です。Cas9とgRNAの発現に独立したベクターを使うメリットは、実験目的に応じて様々なgRNAとCas9（野生型Cas9、ニッケース、不活性型Cas9など）を柔軟に組み合わせて使用できる点です。

当社のAAV gRNA発現ベクターは実験目的に応じてシングルgRNA発現用とデュアルgRNA発現用のどちらかを選択できます。シングルgRNA発現ベクターは遺伝子ノックアウトなどの従来のCRISPRゲノム編集用途に利用され、デュアルgRNA発現ベクターは対となる二つのゲノムサイトを同時に標的にする必要がある用途に利用されます。このような用途例として、１）Cas9ニッケースを用いる実験で、単一の標的部位の両鎖を標的にする2つのgRNAと併用して、シングルｇRNAよりも標的特異性の高いDSBを作り出すこと、２）対となるgRNAペアを利用して2か所のDSBを作り出し、そのあいだの配列の欠失を作り出すこと、３）2つの遺伝子を同時に標的にすることができます。シングルgRNA発現ベクターは２つのITR配列の間にヒトU6プロモーター制御下で標的特異的gRNAを発現するカセットが一つ、デュアルgRNA発現ベクターにはその発現カセットが連続して二つ入るようにデザインされています。

AAV gRNA発現ベクターはE.coliのプラスミドとして作製されています。AAV gRNA発現ベクターがヘルパープラスミドと共にパッケージング細胞に導入されると、ITRのあいだのDNA領域がウイルスとしてパッケージングされます。ウイルスが標的細胞に感染するとgRNA発現カセットはウイルスゲノムと一緒に細胞内に導入されます。gRNAはヒトU6プロモーターから発現されてhCas9を標的ゲノムサイトへ誘導します。

AAV野生株のゲノムはssAAVと呼ばれる、線状の一本鎖DNA（ssDNA）であり、両端にヘアピン構造を持つITRを持ちます。ssAAV上の遺伝子が発現するためにはまず、2つの経路によって二本鎖DNAに変換される必要があります。１）DNAポリメラーゼがssDNAゲノムをテンプレート、3' ITRを複製開始サイトとして相補鎖を複製する。２）ssAAVゲノムのあいだで＋鎖と－鎖のあいだの分子間ハイブリダイゼーションによって二本鎖DNAを作り出す。二本鎖DNAへの変換は主に１）の経路によってなされます。

AAVゲノムDNAは宿主細胞の核内で連結した（コンカテマー）エピソームDNAとして維持されます。エピソームDNAは宿主ゲノム内で複製されないので、AAVゲノムDNAは非増殖細胞では宿主細胞内で維持されますが、増殖細胞では細胞分裂によって希釈されて最終的には消失します。AAVゲノムDNAが宿主ゲノムに挿入されることは非常に稀です。それゆえベクターの挿入によって細胞が癌化する懸念がないのでAAV gRNA発現ベクターは遺伝子治療などの用途に適しています。

AAVは複製不能でヒトに対して炎症反応などの疾患の原因にほとんどならないために、バイオセーフティレベル1の施設で扱うことができるために非常に実用性が高いシステムです。さらに、その抗原性の低さから当社のAAV gRNA発現ベクターはin vivoでCRISPRを使用する用途に最適です。

自然界から単離された複数のAAV株は、ウイルス表面のカプシドタンパク質の抗原性に基づいた血清型で分類できます。血清型によってウイルスの親和性（感染の組織特異性）が変わります。AAVベクターをパッケージングする際には異なるカプシドタンパク質を選択することでウイルスの血清型を変更することができます。当社が提供する血清型は1、2、3、4、5、6、6.2、7、8、9、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYFとなります。クローニングの際、特異性に影響を与えないためにこの分野では一般的であるAAV2由来のITRが使用されています。パッケージング用のヘルパープラスミドにはRep/Capプラスミドがあり、AAV2由来の複製遺伝子と選択した血清型のカプシドタンパク質を含み、向性を決定します。AAVの血清型と組織親和性の対応については下記の表をご覧ください。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

特長

当社のAAVベクターシステムはE.coliでの高コピー数複製、高いタイターのウイルス作製、広範囲な細胞タイプへの効率の高い導入および導入遺伝子の高い発現量を実現します。AAVベクターは高い安全性とパッケージング時にすべてのカプシドタンパク質の血清型を選択できるため、非常に効率の高い遺伝子導入を実現できます。

メリット

柔軟性: 当社のAAV gRNA発現ベクターは実験目的に応じて様々なCas9（ヌクレアーゼ、ニッケース、不活性型ヌクレアーゼ）とともに使用でき、さらにこのAAV gRNA発現ベクターは、シングルgRNA発現用とデュアルgRNA発現用のどちらかを選択して、1か所または同時に2か所のゲノム標的部位を標的にすることができます。

安全性:  AAVは複製不能であり、ヒトの疾患の原因とならないので、最も安全なウイルスベクターシステムです。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い: 宿主細胞への導入後、AAVベクターはエピソームDNAとして細胞核に存在します。宿主ゲノムへの挿入が起こらないので癌化の原因となりうる宿主ゲノムの損傷リスクを減らすことができ、ヒトへのin vivo用途に適しています。

高ウイルスタイター: 当社のAAVベクターは高いタイターのウイルスをパッケージングできます。当社のウイルスパッケージングサービスを利用すれば1013 GC/ml（genome copy per ml）以上を得ることが可能です。

幅広い向性: 適切な血清型でAAVベクターを作製することによってヒト、マウス、ラットなど一般的に使用される哺乳類動物由来の幅広い細胞及び組織タイプに遺伝子を導入できます。ただし、血清型によっては遺伝子導入が難しい細胞タイプがあります。

In vitroとin vivoで有効: 培養細胞と生体内の細胞に対しても使用できます。

デメリット

特定の細胞タイプへの遺伝子導入が困難: AAVベクターは適切な血清型を選択することで非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能となります。それぞれの血清型は異なる組織向性がありますが、どの血清型を使っても遺伝子導入が難しい細胞タイプも存在します。

技術的な複雑さ: AVVベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

PAMが必要: CRISPR/Cas9システムはgRNA標的配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。必要なPAM配列は使用するCas9バリアントに依存します。

基本コンポーネント

シングルgRNA発現AAVベクター

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

U6 Promoter: ヒトU6 snRNAのプロモーター。small RNAの転写をするRNAポリメラーゼIIIによってgRNAを高レベルで発現させる。

gRNA: 使用されるCas9バリアントと適合するガイドRNA。

Terminator: gRNAの転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyエンハンサー/プロモーター。下流のマーカー遺伝子を普遍的に発現させる。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）、視覚化用遺伝子（EGFPなど）、デュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択や可視化を可能にする。

SV40 late pA: SV40（Simian virus 40）の後期ポリアデニル化シグナル。上流ORFの転写を終結する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。5’ ITRの説明を参照。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。E.coliをアンピシリン存在下で培養することにより、プラスミドが維持される。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。