Poly(A)テールがmRNA医薬の可能性を広げる
キーワード: mRNA-polyA-tail, poly(A) tail, mRNA vaccine, polyadenylation
近年における mRNA医薬およびワクチン の進歩は、精密医薬の未来に大きな期待を抱かせています。mRNA送達は、ゲノムへの組み込みの懸念なく、細胞内、膜貫通型、分泌型など、多様なタンパク質の発現を可能にします。その結果、遺伝子疾患、感染症、癌など、幅広い疾患の治療薬開発において利用されるようになっています。特にmRNAは史上初のCOVID-19ワクチンの迅速な設計と製造に不可欠であり、柔軟で費用対効果の高い治療法になり得る可能性を実証しました。mRNA技術は大幅に向上したものの、安全性やGMP規制を遵守しながら、mRNAの安定性、デリバリー、免疫原性を改善するための努力が現在も続けられています。mRNAの安定性と翻訳効率の両方に大きく影響するPoly(A)テールが、RNA研究と最適化の対象となっています。この記事では、in vitro転写（IVT）mRNAのためのPoly(A)テールの付加方法、Poly(A)テールの長さの最適化が治療効果をどのように向上させるか、そして基礎研究および臨床用途のRNA製造において安定したPoly(A)テール付加を達成するためのVectorBuilderの品質管理について解説します。
mRNAの転写メカニズムとPoly(A)テールの重要性
mRNA転写反応は、キャッピング、スプライシング、poly(A)付加が必要となる複雑なプロセスです。これらのプロセスは転写反応と共に遂行され、図1に要約されているような、複数の酵素および制御タンパク質によって調節されます。転写およびスプライシング後、mRNAは通常、5'キャップ、5'非翻訳領域（UTR）、3'UTR、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、および3'Poly(A)テールから構成されます。臨床用途のmRNAは一般的に、mRNAの安定性とターゲティング効率を高めるために、脂質ナノ粒子（LNP）にカプセル化されます。
Poly(A)テールは、ほぼ全ての真核生物mRNAの3'末端に存在する70～200ヌクレオチド長のアデノシンの連鎖であり、mRNAの核外輸送、安定性、および翻訳において極めて重要な役割を果たします。Poly(A)結合タンパク質（PABPs）は、mRNAの安定性を調節する上で二重の役割を担っています。これらのタンパク質は、Poly(A)テールの分解から保護するとともに、エキソソームによる選択的な分解のターゲットとすることが示されています。以前はPoly(A)テールが長いほどmRNAの安定性が高まると考えられていましたが、近年の研究では、Poly(A)テールの長さとmRNAの動態の関係は非常に複雑であり、未だ不明瞭であることが示されています。また、mRNAの安定性の低下がその翻訳効率には関連しないことを示唆されています。
高い翻訳効率をもたらすには、最適なmRNAのPoly(A)テール長があることが報告されています。Poly(A)テールが著しく短い（または長い）場合、翻訳開始に必要なクローズドループ構造の形成を妨げ（または干渉し）、翻訳効率が低下するという仮説が立てられています。これまでの研究によって、Poly(A)テールの長さが、独立した経路でmRNAの安定性と翻訳を調節する重要な役割を果たしていることを示唆しています。これらの現象のメカニズムは、mRNA生物学の発展とmRNAベースの治療法の進歩に重要となりますが、まだ十分に解明されていません。
Poly(A)付加と翻訳調節のダイナミクスを活用することで、mRNAのライフサイクルを操作して治療効果を高めることが可能であり、mRNA治療薬とワクチンを一層前進させることができます。
図1. 核内における共転写ポリアデニル化のメカニズム。各ステップをクリックすると、mRNAプロセシングおよび輸送の主要なコンポーネントと活性に関する詳細情報を表示。 Polyadenylation is initiated the nucleus when cleavage and polyadenylation specificity factor (CPSF) recognizes and binds to a highly conserved hexameric polyadenylation signal (PAS) on the pre-mRNA while cleavage stimulatory factor (CstF) binds to a GU/U-rich region (downstream sequence element; DSE); flanking of the cleavage site (predominantly a CA dinucleotide). Along with cleavage factors I and II (CFI, CFII) as well as the poly(A) polymerase (PAP), CPSF and CstF trigger endonucleolytic cleavage. Next, PAP catalyzes addition of adenine residues to the new 3’ end in a template independent manner. Shortly after synthesis of the poly(A) tail begins, nuclear poly(A) binding protein (PABPN) binds to the newly synthesized poly(A) tail and further stimulates polyadenylation by increasing the affinity of PAP for the poly(A). The CPSF-PAP-PABPN complex continues to elongate the tail until it has reached its appropriate length – at which point CPSF separates from the poly(A) polymerase and PABPN leading to a halt in enzymatic activity and termination of polyadenylation. Following export from the nucleus, the unstable binding of PABPN is replaced by cytosolic poly(A) binding protein (PABPC), which in turn binds to eukaryotic initiation factor 4 complex (eIF4G) on the 5’ end of the same mRNA, induces the formation of a closed-loop structure, and subsequently significantly enhances the initiation of translation.
研究室環境でのPoly(A)テール付加
IVT mRNAのポリアデニル化は、2つの異なる方法（図2）で実現できます。1）酵素的ポリアデニル化、または2）テンプレートエンコード型ポリアデニル化です。
酵素的ポリアデニル化は、in vitro転写反応後に、IVT mRNAをPoly(A)ポリメラーゼおよびATPと共にインキュベートすることで行われ、mRNAの3'末端にアデニン残基が付加されます。この方法の主な利点は、RNA、ATP、酵素の濃度、反応時間、またはこれらの組み合わせを変更することで、様々な長さのPoly(A)テールを柔軟に生成できることです。このアプローチは予備研究や最適化には優れていますが、追加の酵素を使用する必要があるため、特に大規模生産では生産コストが大幅に増加する可能性があります。さらに、単一の反応内で一貫したPoly(A)テールを持つmRNAを生成することができないため、Poly(A)テールの長さに高いばらつきが生じます。
図2. IVT mRNAに使用されるポリアデニル化方法の比較
テンプレートエンコード型ポリアデニル化は、IVT用ベクターにコードされる目的遺伝子の3‘末端にチミンの連鎖をクローニングすることで実現されます。T7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写中に、テンプレート由来のチミンはアデニンに変換され、mRNAの3'末端に組み込まれます。このアプローチの主な利点は、ワンステップ反応であるためコストが削減され、大規模生産において酵素的テール付加よりも適していることです。さらに、この方法では一貫した長さのPoly(A)テールを持つmRNAを生成することができます。しかし、プラスミドDNA上に長い反復配列のチミンを合成、クローニング、および維持することは、様々な理由から極めて困難です。主に、長い反復配列の合成とクローニングは、DNA合成において一般的に制限因子となります。加えて、IVT用ベクターへのクローニングや細菌形質転換後でさえ、細菌宿主株は長いヌクレオチドの連鎖を組換える傾向があり、時間の経過とともにこれらのヌクレオチドの喪失または分解を引き起こします。加えて、反復配列は、サンガーシーケンスのような従来の方法では精度が失われるため、品質管理も複雑にします。
| メリット | デメリット | |
|---|---|---|
| 酵素によるテール付加 |
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| テンプレートエンコード型テール付加 |
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表1. Poly(A)テール付加方法の比較まとめ
最大限の治療効果を得るためのPoly(A)テール付加の最適化
テンプレートエンコード型poly(A)テール付加によって生成されるPoly(A)テールは、高い再現性と簡素化された生産性から、基礎研究および治療目的で使用されるIVT RNAのポリアデニル化方法として一般的に使用されています。長いアデニン連鎖の合成およびクローニングに伴う課題を克服するため、当社は、細菌宿主株で安定して維持することが可能で、最終製品に含まれる副産物量を最小限にする、様々なPoly(A)長を持つIVT mRNAベクターを開発しました（図3）。
図3. 60〜150ヌクレオチドの純粋なPoly(A)テールを含むIVT mRNAベクターの安定性評価。大規模な大腸菌培養液から抽出したプラスミドを制限酵素で切断して、Poly(A)テールを含むセグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動で可視化した。不安定なPoly(A)副産物はスミアとして観察される。
一般的な哺乳類のPoly(A)テールは約200ヌクレオチド長ですが、基礎研究および臨床用途では、より生産が容易で翻訳に十分な安定性を提供できる短いPoly(A)テールが使用されています。当社の研究では、Poly(A)テールの長さが100ヌクレオチドでタンパク質発現が最大になり、それ以上長さを増やしても翻訳効率は向上しないことがわかっています（図4）。
図4. 翻訳効率に対するPoly(A)テールの長さと構造の影響。(A-B) 12ウェルプレートで培養したHEK293T細胞に、同じCap1とUTRを持つが、図に示された異なるPoly(A)テール長さのIVT EGFP mRNAを1 µgトランスフェクションした。トランスフェクション後のEGFP発現をフローサイトメトリーで定量。画像はトランスフェクション24時間後と48時間後に撮影。(C) 1細胞期のゼブラフィッシュ胚に250 pgのゼブラフィッシュEGFP IVT mRNAをマイクロインジェクションし、6時間後のEGFP発現をスクリーニング。
この原則は他のIVT mRNAベクターにも拡張できますが、特定の転写物に対する最適なPoly(A)テールの長さは、ケースバイケースで決定する必要があります。当社は、様々なPoly(A)テール長さの IVT mRNAベクター を提供しており、また、研究者や治療薬開発者が最適な発現を達成できるよう、Poly(A)長さをオーダーメイドで最適化する CROサービス も提供しています。
正確なPoly(A)テールの長さのための品質管理
安定したPoly(A)テールの長さ評価を含むIVT mRNA転写物の品質管理は、最適な性能を確保するために不可欠です。しかし、Poly(A)テールの反復配列は、サンガーシーケンスのような従来の手法では難しく、キャピラリー電気泳動、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）、あるいは次世代シーケンスのようなより高度なシーケンシング手法が求められます。
キャピラリー電気泳動は、Poly(A)テールの長さに関する高分解能データを提供できますが、テストされたPoly(A)テール内のバリエーション、変異、または不純物の存在を検出することはできません。次世代シーケンス（NGS）やPoly(A)-seqのような高度なシーケンシング手法の利用にも多くの制限があります。これには、最終的な測定の精度に影響を与える可能性があるPCR増幅ステップが必要であること、高い複雑性、および/または高コストが含まれます。当社は、IVT反応で生成されたPoly(A)テールの分子量を正確、効率的、かつ迅速に決定するためにLC-MSを利用します。このハイスループットな方法は、Poly(A)テールの長さと不均一性に関する高分解能データを提供するため、図5に示すように、IVT mRNAの品質管理および治療薬開発において不可欠です。
| メリット | デメリット | |
|---|---|---|
| 液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC-MS) |
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| キャピラリー電気泳動 |
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| 次世代シーケンス (NGS) |
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表2: Poly(A)テールの信頼性分析のための一般的な品質管理アプローチの比較
図5. Poly(A)テール長分析。IVT mRNAからリボヌクレアーゼT1を用いてPoly(A)テールを切断し、オリゴdTアフィニティークロマトグラフィーによって単離。単離したPoly(A)テールを(A)尿素-PAGEゲル電気泳動および(B)LC-MSで分析。デコンボリューションスペクトルは、予想サイズ120 ntの120 pmolのPoly(A)テールから生成。(C)予想サイズ120 ntのPoly(A)テールのサイズ分布。この範囲外の他の転写物は検出されなかった。エラーバーは3回測定値の標準偏差を表す。
最後に
mRNAのポリアデニル化は、細胞質における安定性と効率的な翻訳にとって極めて重要です。細胞内では、ポリアデニル化は、高度に調節された酵素的プロセスによって共転写的に達成されますが、研究室では、2つの方法によって再現されています。どちらの方法にもそれぞれ独自の考慮事項がありますが、テンプレートエンコード型テール付加は、Poly(A)テールの一貫性、コストと変異リスクの低さ、およびGMP規制との互換性から、最も広く使用されている方法となっています。
ベクターの設計と開発における当社の幅広い専門知識をもつVectorBuilderは、テンプレートエンコード型テール付加に関連する課題を克服し、高度のPoly(A)テール長を持つIVT mRNA転写物を製造することができます。様々なPoly(A)テール長をもつベクターが提供されているため、研究者や医薬品開発者がmRNAの効率的な翻訳に必要な長さを最適化することが可能です。当社が提供する 治療用IVT RNA開発 のための広範なend-to-endソリューションには、最適な発現と効率のための 非翻訳領域（UTR）、コーディング配列、Poly(A)テール長の最適化 、およびターゲティングを強化するためのUTRエンジニアリングと 脂質ナノ粒子（LNP） の最適化が含まれます。IVT mRNAの最適な設計、製造、および広範な品質管理を達成するために、当社とどのように連携できるかについては、当社の 治療用IVT RNAのページをご覧ください。
参考文献