プラスミドの収量が少ない

プラスミドが低コピーの複製起点を持っている

バクテリア細胞あたりのプラスミドのコピー数はプラスミド上の複製起点によって決定されます。いくつかの複製起点は低コピー数の性質を持ちます。プラスミドの複製起点のコピー数を確認してください。低コピープラスミドの場合は、十分なプラスミド収量が期待できるようにE.coliの培養スケールを増やしてください。

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プラスミド抽出用カラムに対するバクテリアの培養スケールが小さい

プラスミドが高コピーもしくは低コピーかどうかと、プラスミド抽出カラムのDNA結合容量を確認してください。ミニプレップの場合、終夜培養した1‐5mlのバクテリアを用意してください。マキシプレップかつ高コピープラスミドの場合は100‐150ml、低コピープラスミドの場合は300‐500mlの終夜培養液をお勧めしています。通常、高コピープラスミドの場合、1mlあたり約5ug、150mlあたり約500ugのプラスミドが得られ、低コピープラスミドの場合、1mlあたり約1.5‐2.5ug、150mlあたり約150-200ugの低コピープラスミドが得られます。

培養液中のバクテリアの一部だけがプラスミドを保有している

いくつかの抗生物質(特にアンピシリン)は培養液内で急速に分解されます。その結果、プラスミドを持たないバクテリアが培養液中で増えてしまい、プラスミドの回収率が落ちます。これを避けるために、常に新鮮なアンピシリンを含む培養液を準備してください。また、アンピシリン耐性バクテリアを培養するときには、培養液が長時間飽和状態にならないよう気をつけてください。古い培養液では多くのバクテリアが死んでおり、それらのプラスミドDNAは分解しているので古い培養液からプラスミドDNAを抽出すると回収率が低下します。そのため、新鮮な培養液からプラスミドDNAを抽出してください。もしプラスミド抽出がすぐにできないならば、バクテリアを遠心分離して‐80℃で保存することができます。

スタブカルチャーから培養を始めた

ベクタービルダーから受け取ったE.coliの液体ストックもしくはスタブカルチャーから直接培養すると、プラスミド収量が低くなることがあります。まず始めにベクタービルダーのストックから適切な抗生物質を含んだLB培地にストリークして、そこから増殖してきた新鮮なコロニーを液体培地に植え付けることをお勧めします。詳細な手順についてはメニューのラーニングセンター>ドキュメント>スタブカルチャーをご覧ください。

プラスミド抽出キットの取扱説明書に従っていない

取扱説明書をよく読んでキットをお使いください。間違った使い方では回収率が悪くなります。

ミニ/マキシプレップカラムの品質が低い

他社のプラスミドDNAカラムでは再現性が低く、低品質のものがあります。