水疱性口内炎ウイルス (VSV) CoV S-protein シュードタイプ

ベクタービルダーでは、コロナウイルス研究用に、コロナウイルスのスパイク (Spike: S) タンパク質エンベロープを持つCoV-Sシュードタイプ 水泡性口炎ウイルス(VSV)を受託構築いたします。

コロナウイルスのスパイク (Spike: S) タンパク質は、ウイルスエンベロープに埋め込まれたウイルス受容体で、ウイルスが最初に宿主細胞表面に付着した際に、宿主細胞上の相補的受容体に結合し、さらにウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合を促進し、ウイルスが宿主細胞内に侵入するメカニズムを担っています。コロナウイルスやレンチウイルスなどのエンベロープウイルスの場合、外界に接している脂質二重膜のエンベロープに、ウイルス受容体タンパク質が固定されているのが特徴です。

コロナウイルスは、宿主・組織特異的な指向性を持つウイルスとして大きな一群を形成しています(図1)。1種のコロナウイルスが効果的に感染できる生物種は1種のみ、あるいは2-3種に限定されています。この指向性は、その名前の由来ともなっているように王冠(コロナ:ギリシャ語で王冠を意味する)様の外観を提示するスパイク(Spike: S)タンパク質と宿主細胞表面の受容体の結合で説明されています。例えば、SARS発症ウイルスのSARS-CoV、およびCOVID-19発症ウイルスのSARS-CoV-2は、ヒト呼吸器、肺、および口腔上皮細胞表面上に存在するアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)にSタンパク質が結合することによりヒトに感染します。一方、MERS-CoVは、ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP-4)受容体への結合を介してヒトに感染します。

コロナウイルスの宿主細胞への感染メカニズム研究にシュードタイプ水泡性口炎ウイルス(VSV)を使用

ウイルスの宿主上皮細胞への感染サイクルの最初のステップは、ウイルスの宿主細胞表面への吸着と侵入です。吸着のステップは、ウイルス表面に存在する特異的受容体が、宿主細胞膜の相補的受容体に結合することで発生します。コロナウイルスの細胞侵入および宿主生物種を限定する指向性の進化メカニズムを理解するためには、異なるコロナウイルス種のSタンパク質と宿主受容体との相互作用を理解することが必須です。しかし感染力が高く、効果的なワクチンが無い状態では、生きたウイルスの産生および取り扱いは研究を進める上で大きな障害となり、研究者への感染リスクも高くなります。

代替方法としてコロナウイルスのSタンパク質を外套したシュードタイプ水泡性口炎ウイルス(VSV)を利用し、生きたコロナウイルスを扱うことなくコロナウイルスの細胞侵入のメカニズムを研究する方法が提案されます。コロナウイルスと水泡性口炎ウイルスは、ともに外層が脂質二重膜からなるエンベロープウイルスで、吸着する宿主・組織特異性を決める受容体タンパク質が外界に向かって突出した形状を取っています。シュードタイプ水泡性口炎ウイルスのパッケージングの際、通常のVSV-Gエンベロープの代わりに、コロナウイルスのSタンパク質をウイルス産生細胞の細胞表面に高発現させ、ウイルス粒子を産生させます。このように作成されたシュードタイプ(偽型)ウイルスは、ウイルス表面に提示されたSタンパク質と宿主細胞の受容体との結合を介して宿主細胞に侵入するメカニズムを模倣しています。さらにSタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、受容体との相互作用や中和抗体検出系の解析などにも応用できます。シュードタイプ水泡性口炎ウイルスは、バイオセイフティー基準を満たした安全な取り扱い下で研究を行うことが可能となっています。

ベクタービルダーは、様々なコロナウイルス種のSタンパク質エンベロープを持ったシュードタイプ水泡性口炎ウイルスを受託構築し、ready-to-useの状態でユーザーに納品します。トランスファーベクターに解析を行う遺伝子ORFをクローニングしたり、EGFPやルシフェレースなどのレポーター遺伝子をクローニングすることで、ウイルスの宿主細胞への侵入をライブ検証するなど様々なアッセイツールの開発にもお使いいただけます。

価格と作業日数
サイズ 推奨使用系 タイター 容量 価格 (税抜き) 作業日数
VSV :VSV Gタンパク質シュードタイプ
中容量 培養細胞 >107 PFU/ml 1 ml (10x100 ul) 117,000円 35-42 日
大容量 >108 PFU/ml 169,000円
超純粋中容量 培養細胞 & in vivo >108 PFU/ml 500 ul (5x100 ul) 208,000円
超純粋大容量 1 ml (10x100 ul) 468,000円
VSV :SARS-CoV-2 S タンパク質(野生型または変異型)シュードタイプ (トランスジーン:LucまたはEGFP)
中容量 培養細胞 >106 PFU/ml 1 ml (10x100 ul) 234,000円 28-35 日
大容量 >107 PFU/ml 338,000円
VSV :SARS-CoV-2 Sタンパク質(野生型またはバリアント)シュードタイプ  (カスタムトランスジーン)
中容量 培養細胞 >106 PFU/ml 1 ml (10x100 ul) 234,000円 42-56 日
大容量 >107 PFU/ml 338,000円

PFU = プラーク形成ユニット

納品形態
培養細胞用スケール 超純粋スケール
カスタムVSV カスタムVSV

無料: 標準コントロールウイルス

  • 中容量: >10 PFU/ml, 2x100 ul
  • 大容量: >108 PFU/ml, 2x100 ul

  追加購入(オプション): 超純粋標準コントロールウイルス

  • 超純粋中容量: >108 PFU/ml, 5x100 ul, 78,000円
  • 超純粋大容量: >108 PFU/ml, 10x100 ul, 156,000円
トランスファープラスミドの種類 

トランスファープラスミドのデザインは下のベクターピッカーよりレポーターの選択で簡単デザインも行えます:

ベクターピッカー

シュードタイプに使われるVSVベクターのマップ

カスタムデザインのトランスファープラスミドやエンベローププラスミドの受託構築もお受けしています。カスタムデザインとウイルスパッケージングは次のリンクよりご依頼ください:

オンラインでベクターデザインを行う
カスタムベクターやウイルスパッケージングのデザインリクエストを送る
シュードタイプ化に用いるスパイク(S)タンパク質

コロナウイルスは自然界に非常に多種類が存在し、巨大なウイルス群を構成しています。事実上、全ての哺乳動物と鳥類に感染することが明らかになっています。何百ものコロナウイルス種が同定されていますが、その中でも特に、ヒト、家畜、ペット、モデル動物に感染性のある数十種、およびその近縁種が重要であると考えられています:

主要コロナウイルス種間の系統樹

これらの重要なコロナウイルス種に関しての解説は下表をご覧ください:

主要なコロナウイルス種の解説

VectorBuilderでは上の表の様々なコロナウイルス種のSタンパク質を使ったシュードタイプウイルスを受託作製しています。この表に無いコロナウイルス種のSタンパク質を使ったシュードタイプウイルスも受託いたします。お問合せください。 

SARS-Cov-2 Sタンパク質の場合は、複数の変異型Sタンパク質でシュードタイプ化のオプションもご提供しています。変異型のリストは下の表をご覧ください:

VectorBilderでご提供している
SARS-CoV-2 Sタンパク質変異型

ネガティブコントロールとしてお使いいただけるエンベロープタンパク質を発現していないbald (禿型)VSVもご用意しています。

実験による検証

VectorBuilderは独自技術を開発、改良し、シュードタイプ化VSVウイルス用のプロトコールを最適化しました。その結果、当社のシュードタイプウイルスは、一般に広く公開されているプロトコールを使って作製した場合に比較して、はるかに高い形質導入効率を示します。当社で作製したシュードタイプVSVウイルスを様々な実験で検証を行いました。一例として、以下(図1)に示すように、SARS-CoV-2 野生型Sタンパク質とそのD614G変異型Sタンパク質をシュードタイプ化したVSVを、SARS-CoV 2の受容体であるヒトACE2を高発現するBHK-21細胞に改質導入実験を行いました。ACE2を高発現するBHK-21細胞は、野生型Sタンパク質VSV、およびD614G変異型Sタンパク質VSVで形質導入されました。形質導入された細胞は、蛍光レポーター(EGFP)を発現しています。しかし、ACE2の発現が極めて低いまたは発現していないBHK-21細胞では、蛍光レポーターを発現する細胞が観察できないことから、受容体ACE2依存的な宿主細胞への感染と形質導入が示されます。

S-pseudotyped VSV D614G S-pseudotyped VSV

BHK-21 cell line BHK-21-ACE2 cell line

図 1. SARS-CoV-2 Sタンパク質(野生型とD614G変異)のシュードタイプレンチウイルスはヒトACE2受容体を発現するBHK-21細胞に感染する。トランスダクションから24時間後の細胞を撮影した。 倍率: 100x。

シュードタイプVSVの受託サービスを依頼するには?

シュードタイプVSVのご依頼は、次のデザインリクエストを送るを使って、ご希望の条件をお問合せください。サービスプロポーサルを作成いたします:

シュードタイプVSVのデザインリクエストを送る
バイオセイフティーに関してのご注意 

組み換えレンチウイルスを用いる研究は、所属機関の組み換えDNA実験安全委員会の指示に従い、研究目的に相当するバイオセイフティー基準を満たし、各担当省庁のカルタヘナ法指針に基づいて拡散防止措置を取り、トレーニングを受けた研究員がPPEで保護をしたうえで安全に十分注意して実施してください。様々なコロナウイルス種に対してのバイオセイフティーのガイドラインは、 American Biological Safety Association (ABSA)より発行されている、 Risk Group Database よりご確認ください。またはNIHのInterim Laboratory Biosafety Guidance for Research with SARS-CoV-2 を参考にしてください。日本でのSARS-CoV-2関連遺伝子を使った研究に関する規制詳細は研究を実施するユーザーより担当省庁にご確認いただき、組み換えDNA実験の法令を遵守してください。SARS-CoV-2に関する文部科学省管轄では、研究開発二種告示、別表第2に新型コロナウイルスが追加され、大臣確認申請は不要になりました。ただし、別表第一第一号イ以外の項に該当する場合は大臣確認申請が必要です。拡散防止区分の変更や新たな大臣確認申請が必要となる場合があるかもしれないため、文部科学省の告示なども事前にご確認ください。ご参考までに。拡散防止措置有効性のリンクも示します。また、経産省の産業二種使用のリンクはこちらです。シュードタイプVSVは届出伝染病等病原体所持の手続きが必要です。当社のVSVはIndiana株です。

納品物 
  • カスタムレンチウイルス CoV S-protein シュードタイプ
  • カルタヘナ法26条1項情報公開書類(メール添付)
  • ウイルス品質試験証明書(COA)