RCASレトロウイルス作製サービス
組換えRCAS（Replication-Competent Avian Sarcoma-Leukosis Virus long terminal repeat with a Splice acceptor）レトロウイルスベクターは、鳥類およびTVAを導入した哺乳類システムへの、安定かつ効率的な遺伝子導入を可能にする優れたツールです。本システムは、機能解析、発生生物学、医薬品開発、および発がん経路のモデリングに関連したin vitroおよびin vivoアプリケーションに対して、堅牢で信頼性の高いプラットフォームを提供します。
提供RCASタイプ
- サブグループA（TVA受容体）への特異的エンベロープを持つRCAS Bryan Polymerase（BP）株；RCASBP(A)
サービス詳細
価格と作業日数 プライスマッチ
| スケール | 用途 | タイター | 容量 | 価格 (税別、送料別) | 作業日数 |
|---|---|---|---|---|---|
| 超遠心パイロット | 細胞培養およびin vivo | >1.0 x 107TU/mL | 100 ul (10x10 ul) | 310,000円 |
21-33日
|
| 超遠心中容量 | >1.0 x 108 TU/mL | 100 ul (10x10 ul) | 558,000円 | ||
| 超遠心大容量 | >1.0 x 108 TU/mL | 1 ml (10x100 ul) | 1,023,000円 |
ヘルパーウイルス
RCASのトランスダクションには、標的細胞が鳥類TVA受容体を発現している必要があります。お使いの実験システムが対応していない場合は、トランスダクションを補助するTVA発現ヘルパーウイルスをご購入いただけます。詳細は以下をご覧ください：
コントロールウイルス
コントロールRCASは、生物学実験に適合するよう設計されており、RCASのトランスダクション検証用として使用されます。例えば、カスタムウイルスが遺伝子を過剰発現する場合、提供されるコントロールウイルスはEGFP発現コントロールRCAS（EGFPを過剰発現するRCAS）となります。コントロールRCASの詳細情報は以下の通りです：
出荷形態と保存方法
当社のRCASBP(A)レトロウイルスはHBSSバッファーに保存されており、ドライアイス梱包で出荷されます。お受け取り後は、長期保存（少なくとも6ヶ月間安定）の場合は-80℃で、1週間以内に使用する場合は-20℃で保存してください。RCASウイルスの使用期限は約1年です。ウイルスタイターの大幅な低下を招くおそれがあるため、RCASウイルスの凍結融解の繰り返しは避けてください。
技術情報
RCAS製造および品質管理 (QC)
RCASパッケージングでは、目的遺伝子（GOI）を搭載した発現ベクターをDF-1ニワトリ細胞にトランスフェクションします。3〜6日間の培養期間後、上清を回収し、その後細胞を継代・拡大してRCASの増幅を行います。3〜5日間の増幅後、ウイルスを含む上清を回収し、事前に回収していた上清と合わせます。回収した上清はPEG沈殿により濃縮されます。最終的に、ショ糖密度勾配超遠心法によってウイルス粒子がさらに精製されます。
VectorBuilderが製造する組換えRCASの品質管理には、TCID50によるタイター測定、細菌および真菌の無菌性試験、マイコプラズマ検出が含まれます。RCASベクターが蛍光タンパク質を搭載している場合、ウイルス増幅中に蛍光発現が確認されます。薬剤選択マーカーをコードするRCASベクターについては、薬剤選択を伴うトランスダクション試験が実施されます。さらに、超遠心純度RCASについては、エンドトキシンレベルを確認するためにエンドトキシン測定を定常的に行います。品質検査証明書（COA）にエンドトキシンの結果を含めるには、追加費用が必要となります。ご要望に応じて、追加のQCサービスもご提供可能です。
RCASベクターの主な用途
RCASベクターは、TVA発現細胞に特異的かつ効率的に遺伝子を送達できるため、鳥類および哺乳類の両方のシステムにおける多様な実験に有用です。以下に、現在RCASベクターが使用されている主な研究分野を紹介します：
機能ゲノミクス
RCASは、遺伝子機能、シグナル伝達経路、および遺伝子的相互作用を調査するため役立ちます。RCASは鳥類モデルにおいて効率的なin ovo遺伝子操作を可能にし、発生中の組織に安定した遺伝子の過剰発現、遺伝子ノックダウンまたはノックアウト、およびレポーター発現コンストラクトを導入するために使用されてきました。これにより、細胞移動、系統追跡、組織形態形成などのプロセスにおける特定の遺伝子の役割を詳細に調べることができます。
哺乳類モデルにおける標的化RCAS感染は、特定の細胞集団への遺伝子、変異バリアント、または遺伝子サイレンシングコンストラクトの送達を可能にし、遺伝子機能を研究するための正確な空間的制御を提供します。この特異性は、多くの場合、トランスジェニックマウス（例えばCre-loxマウス）や組織特異的プロモーターの使用を通じて、TVA受容体の発現を特定の細胞型に限定し、それによってウイルス感染を選択された細胞集団に制限することによって達成されます。例えば、RCAS-CRISPR/Casモデルはin vivoでの体細胞遺伝子ノックアウトの作製を可能にし、生殖系列ノックアウトマウスを作製することなく機能解析を行うことができます。RCASにより、遺伝子機能の迅速な調査が可能になり、組織内でのモザイク的な遺伝子操作が容易になります。これは、複雑な生物学的システムにおける遺伝子相互作用を研究するのに特に有用です。
発生生物学
RCASベクターは、発生の早期段階で導入遺伝子の発現を可能にするため、鳥類モデルにおける発生生物学の研究に特に適しています。感染可能な鳥類細胞における複製能を持つ性質により、ヘルパーシステムを必要とせずに、細胞間の拡散によってウイルスが増幅されます。これは鳥類胚モデルにおいて特に強力であり、局所的な感染により、in vivoでの発生プロセス（例えば神経パターニングや肢の発達）の研究のために、空間的および時間的に制御された遺伝子発現が可能になります。
哺乳類モデルにおいて、RCAS-TVAシステムは神経前駆細胞、肝臓前駆細胞、または造血細胞を標的にするために使用されてきた実績があります。RCASBP(A)ベクターは、脳の発達を研究するためにTVA発現神経幹細胞においてシグナル伝達モジュレーターを発現させるために使用されており 、時間を制御したRCASの注入は、発生中の組織においてステージ特異的な操作を可能にするために使用されてきました。これにより、最終的に発生研究において細胞の運命や系統を効果的に追跡することが可能になります。
がんモデリング
RCAS-TVAシステムは、極めて高い細胞型特異的な方法で遺伝子を送達できるため、がんのモデリングのための強力なプラットフォームです。例えば、組織特異的プロモーターなどを用いてTVA受容体を発現するように細胞やマウスを改変することにより、ウイルス感染、ひいては遺伝子発現が特定の細胞集団に制限されます 。これにより、オフターゲット効果を最小限に抑えながら、がん発生の制御されたモデリングが可能になります。
RCASBP(A)ベクターは、腫瘍の発生、進行、および腫瘍形成に関与する遺伝子相互作用を研究するために、がん遺伝子、活性化シグナル伝達タンパク質、またはCRISPR/CasコンストラクトをTVA発現細胞に導入するために使用されてきました。この実験モデルは、腫瘍生物学の理解を深め、実験条件をコントロールすることで潜在的な医薬品用戦略を評価するために非常に有用です。
実験による検証
当社のRCASウイルスは十分に検証されており、鳥類および哺乳類 システムの両方で高いトランスダクション効率を示します。
- 鳥類遺伝子発現
- 哺乳類遺伝子発現
図1. RCASベクターシステムを用いたEGFP発現ニワトリ胚線維芽細胞の作製。(A) RCASをパッケージングし、未処置のDF-1細胞への感染に使用（MOI = 3） 。EGFPの蛍光強度は、感染4日後にフローサイトメトリーを用いて定量した。(B) 代表的な蛍光顕微鏡画像。露光時間：明視野＝10 ms、EGFP＝100 ms。倍率：100倍。(C) RCAS-EGFPを感染させたDF-1細胞は、EGFP発現において約95%の増加を示した。
図2. RCASベクターシステムを用いたEGFP発現HEK293T-TVA細胞の作製。(A) RCASをパッケージングし、野生型またはTVA発現HEK293T細胞のトランスダクションに使用（MOI = 30） 。EGFPの蛍光強度は、トランスダクション3日後にフローサイトメトリーを用いて定量した。(B) 代表的な蛍光顕微鏡画像。露光時間：明視野＝10 ms、EGFP＝100 ms。倍率：100倍。(C) RCAS-EGFPを感染させたHEK293T-TVA細胞は、EGFP発現において約72%の増加を示した。
注文方法
ユーザーご提供のベクター
ユーザー提供のRCASBP(A)プラスミドを使用する場合は、マテリアルサブミッションガイドラインに従ってマテリアルを準備し、弊社に発送してください。素材の遅延や破損を防ぐため、ガイドラインを厳格に遵守して発送手続きを行っていただきますようお願いいたします。ユーザーからご提供されるマテリアルはVectorBuilderで受け取り後、品質検査（QCチェック）に合格する必要があり、項目ごとに16,000円の追加料金が発生する場合があります。ご提供いただいた素材がQCに合格するまで、製造を開始できませんのであらかじめご了承ください。
リソース
Q&A
RCASは一般に、鳥類肉腫・白血病ウイルス（Avian sarcoma-leukosis virus）に由来する複製可能レトロウイルスベクターのファミリーを指します 。VectorBuilderは、サブグループA（TVA受容体）へのエンベロープ特異性を持つBryan polymerase（BP）株に基づく派生型であるRCASBP(A)ベクターを提供しています 。この派生型は、細胞毒性が低く、高いウイルスタイターが得られるため、最も一般的に使用されています 。
VectorBuilderが製造する組換えRCASベクターは、鳥類エンベロープを含み、TVAを発現していない哺乳類細胞には感染しないため、通常はバイオセイフティーレベル1（BSL-1）の施設で扱うことができます 。ただし、バイオセイフティーに関する方針は研究機関によって大きく異なる場合があります 。したがって、各所属機関のバイオセイフティーガイドラインに従って、すべてのウイルスベクターを適切に使用してください。
