ヒトホールゲノムORF発現ライブラリー

VectorBuilderは、当社の所有するヒトホールゲノムOpen Reading Frame(ORF)コレクションを活用し、さまざまな過剰発現スクリーニングに対応できるORFライブラリー構築サービスおよびスクリーニングサービスを提供しています。個々のORFクローンは完全に配列検証されており、任意のバックボーンを使用した、プール型またはアレイ型のプラスミドDNAまたはウイルス粒子としてカスタムスクリーニング用ライブラリを費用対効果の高い方法で迅速に構築できます。加えて、ライブラリー内の個々のORFは、ユニークなバーコードで紐づけされているために、スクリーニングが容易になります。Gain-of-function実験やCRISPRまたはRNAiの実験結果の検証に最適な当社のORFライブラリーは、遺伝子機能、疾患メカニズム、治療応答の調査、および創薬プロセスの合理化に役立ちます。

特長

16,000以上のヒトタンパク質をコードする配列検証済みのORFは、短い作業期間でORF発現ライブラリーの作製を可能にします。

バックボーン（非ウイルス、ウイルス、トランスポゾン）、プロモーター、マーカー、タグから幅広く選択できるベクターデザイン。ユニークなバーコードで識別された各ORFはスクリーニングを容易にする。

プール型またはアレイ型として構築可能であり、大腸菌グリセロールストックやスクリーニングに使用できるプラスミドまたは高タイターウイルスとして納品。

in vitroまたはマウス、ラット、非ヒト霊長類（NHP）を含むin vivoモデルで、プール型ライブラリーを使用した強力なハイスループットスクリーニング。

拡張可能なバイアスのないスクリーニング、マルチプレックス解析等を実行で

きるライブラリーのデザインとスクリーニング戦略への包括的な技術サポート

ORF発現ライブラリーのデザインについて専門チームに問い合わせる

コレクションから遺伝子を選ぶ

ライブラリークローニング

ライブラリー QC

ウイルス
パッケージング

In vitroまたはin vivo
スクリーニング

候補の同定

サービス詳細

サービス	概要	価格（送料、手数料別）	作業期間
ライブラリーデザイン	専門チームによる、実験目的に最適なライブラリーデザインのカウンセリング。スクリーニングプランに適したベクターシステム、プロモーター、タグ、マーカーを選択して、シグナル/ノイズ比が高く、バイアスのない結果が得られるデザインをサポート。	無料	1-4日
ライブラリークローニング	配列検証済みORFをベクターバックボーンに大量並行クローニングと厳密なQCを実行。プール型ライブラリーとして、高いカバレッジと均一性を保証。大腸菌グリセロールストック、スクリーニングに使用できるプラスミドまたは高タイターウイルスとして納品。アレイ型ライブラリーは、96ウェル、384ウェルプレートまたはマトリックスチューブとして納品。	お問い合わせください	2-3週
ウイルスパッケージング	ライブラリープラスミドを高いカバレッジと均一性で高タイターのウイルスにパッケージング。ウイルスパッケージングサービスについての詳細は、こちらをご覧ください。	お問い合わせください
プール型ライブラリースクリーニング	プール型ORFライブラリーを用いた、効率的なin vitroまたはin vivoスクリーニングの実施。In vivoスクリーニングは、げっ歯類または非ヒト霊長類モデルを使用可能。バーコードの搭載によるDNAまたはRNAレベルのNGS検証。
候補の同定	スクリーニングサンプルからのゲノムDNAまたはRNAの調製、NGSとデータ解析。生データ、解析データおよびプロジェクトレポートを提出。

技術情報

遺伝子リスト

当社のORFコレクションは、100bp～10,000bpDNA長の16,000以上の遺伝子が含まれ、細胞分裂/増殖、免疫反応、分化・発生などの複数のカテゴリーとパスウェイをカバーしています。当社のライブラリーに含まれる全遺伝子リストのダウンロードはこちらから。.

ライブラリーデザイン

スクリーニングを成功させるためには、注意深いライブラリーデザインが必須です。ORFライブラリーのデザインに重要な考慮点は：

遺伝子デリバリーベクター：ORFライブラリーにウイルス、非ウイルス性ベクターシステムには、それぞれメリットとデメリットがあります。非ウイルス性ベクターのうち、標準プラスミドはシンプルで費用対効果が高く、一過性発現に適しています。PiggyBacは搭載可能DNAサイズの大きい非ウイルス性ベクターのトランスポゾンベクターとなり、ベクターDNAが宿主ゲノムに挿入されます。ウイルス性のレンチウイルスベクターは宿主ゲノムへの安定したベクター挿入と長期間の遺伝子発現を可能にします。AAVはゲノム挿入が起こらないために、特にin vivoでの安全性が高い、効率的なシステムとなりますが、搭載可能DNAサイズが小さいというデメリットもあります。
プロモーター：実験目的に応じて、恒常的、誘導型、および組織特異的なプロモーターを使い分けてください。例えば、in vivoスクリーニングでは組織特異的プロモーターが役に立ちます。プロモーターについてはこちらをご覧ください。
薬剤選択マーカー:ベクターに抗生物質耐性遺伝子を組み込むことで、形質転換に成功した細胞を選択できます。すでに抗生物質耐性を持つ細胞株(例えば、293T細胞はネオマイシン耐性)を扱う場合は、ライブラリーに搭載するに選択マーカーは別の薬剤耐性遺伝子を選択してください。一般的に、ピューロマイシン耐性遺伝子は、細胞を迅速かつ効果的に選択できるので推奨しています。その他のオプションについては、こちらをご覧ください。
タンパク質タグ:タンパク質にHisタグやFLAGタグなど、またはGFPやmCherryなどが付加されると、発現したORFの検出、精製、および局在決定に役立ちます。VectorBuilderのタグのコレクションは、こちらをご覧ください。
蛍光/発光レポーター: 蛍光または発光レポーターをORFに付加すると、タンパク質の可視化や細胞のソーティングが可能になり、細胞の挙動をリアルタイムで追跡できるようになります。実験目的に応じて、レポーターをORFと直接融合させて標的タンパク質を局所的に追跡する、または異なるプロモーター下流で発現させてモニタリングを行うことができます。当社のリポーターについては、こちらをご覧ください。
バーコード: 細胞/分子バーコードを使用すると、プール型スクリーニングにおいて大量のORFを安価で分析可能になります。ベクターにバーコードの設置を検討する際には、確実にシークエンスできること、ライブラリーへのクローニング、スクリーニング、およびデータデコンボリューションプロセスなどに問題が生じないように戦略的なデザインが必要になります。

当社のデザインチームが、実験ニーズを満足するORFライブラリーのカスタマイズをサポートします。詳しくは、デザインリクエストからお問い合わせください。

プール型とアレイ型ライブラリー比較

VectorBuilderのORFライブラリーはプール型とアレイ型のどちらかを選択できます。両者にはメリットとデメリットがあります。

属性	プール型	アレイ型
構造	バーコード付きORFプラスミド or ウイルスが混合されている	個々のORFプラスミドor ウイルスは、マルチウェルプレートに分注されている
スクリーニング	ハイスループットスクリーニング	個別ORFの構造的解析
解析	対照群と実験群を用いて大量のORFを同時解析	ウェルあたり1つのORFを解析
利点	大規模スクリーニングによって、短期間かつ安価で大量のORF同時解析が可能	実験条件を精密に制御することで、クロスコンタミネーションを最小限に抑える
制限	追加のデコンボリューション作業と検証ステップを経ないと、表現形の原因ORFを同定することが難しい	各ORF個別の操作と解析が必要で、労力と高コストかかる

in vitroおよびin vivoスクリーニング

VectorBuilderの専門チームが、 ORFライブラリーのin vitroおよびin vivoシステムのプール型スクリーニングによって選別された遺伝子の同定を行います。In vitroスクリーニングは迅速かつ技術的に簡単で、選択した細胞株を使用して実施されるため、発現差のある遺伝子を短期間に同定できます。in vitroに最適化されたベクターは in vivoで同じように機能しないケースや、 in vitroとin vivoで発現パターンが変化するケースなどin vitroと in vivo間でのベクターの運用には潜在的な制限があります。

ORFライブラリーによって、培養が困難な細胞や複雑な組織構造内に存在する細胞をスクリーニングするためには、in vivo動物モデルは信頼性の高いプラットフォームとなります。マウスとNHPの両方がin vivoスクリーニングに使用されますが、遺伝子治療の有効性を高めるためには、ヒトとの類似性が高いNHPモデルが採用されます。in vivoスクリーニングには、尾静脈、顔面静脈(新生児マウスおよびラット用)、脳室内、網膜下注射、硝子体内注射、鼓室内注射、筋肉内注射など、さまざまな投与経路が利用可能です。動物実験はすべてAAALACの認定施設で行われています。

ORFライブラリーを標的細胞または動物に送達した後、レポーター遺伝子またはバーコードの発現を測定することによって、ターゲットの活性を評価します。ターゲットの確実な同定のために、スクリーニングを複数回実行することも可能です。スクリーニング後、ゲノムDNAまたは全RNAの単離とそれに続くシーケンシングおよびデータデコンボリューションによってenrich/depletion分析が行われます。