AAVカプシド指向性進化

組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）は、広範な指向性、持続的なトランスジーン発現、および低い免疫原性から、遺伝子治療やワクチンに広く利用されています。しかし、既存のセロタイプだけでは、組織特異性の不足によるオフターゲットへの感染リスクと低いデリバリー効率、既存の中和抗体、製造上の課題といった限界があります。当社のカプシドエンジニアリングプラットフォームは、お客様の治療開発目標に合わせた、優れた特性を持つ新規AAVバリアントの開発を効果的かつ効率的にサポートします。

特長

フルサービスプラットフォーム
ベクターデザインからGMP製造に至るまで、AAVのあらゆる前臨床および臨床ニーズに対応する世界唯一のワンストップソリューション。

最適化されたライブラリーデザイン
当社の専門知識を活用して最適な複雑度を持つライブラリーをデザインし、多彩なアプローチを用いて多様なカプシドライブラリーをカスタム構築。

高品質なライブラリーパッケージング
当社独自のパッケージングプラットフォームを活用し、対応するカプシドバリアントを確実に保持したウイルス粒子を高タイターで製造。

強力なスクリーニング実施能力
AAALAC認定施設でマウス、ラット、非ヒト霊長類（NHP）の堅実なin vitroおよびin vivoスクリーニングを実施。

サービス詳細および技術情報

AAVカプシドライブラリーの構築とスクリーニングにより、1) 特定の組織や臓器内の標的細胞への効率的な感染、2) 細胞タイプ特異的な受容体への高親和性結合、3) 中和抗体の回避、といった高い治療ポテンシャルを持つカプシド候補を同定することが可能です。AAVカプシド進化の一般的なワークフローを以下に示します。

カプシドバリアントの
作製

カプシドライブラリーの
構築

ウイルスパッ
ケージング

in vitroおよびin vivo
カプシドスクリーニング

新規カプシドの検証

以下は、多様なAAVカプシドバリアントを作製するための一般的な技術です。作製されたバリアントをAAVベクターに大規模並列クローニングすることで、rep遺伝子とカプシド遺伝子バリアントをそれぞれ含むキメラAAVゲノムを形成し、カプシドライブラリーを構築します。

ランダムペプチドディスプレイ

Error-prone PCR

DNAファミリーシャッフリング

In silico デザイン

ランダムペプチドディスプレイ

ランダムペプチドディスプレイは、通常7～9個のアミノ酸からなるランダムなペプチド配列をAAVカプシドの特定部位に挿入する手法です。これにより、ウイルスの本来の細胞相互作用を変化させ、特定の細胞受容体へ標的を変更する（リターゲット）ことを目的としています。ペプチドは通常、表面に露出しやすく、ウイルスとホストの相互作用に不可欠なカプシド部位に挿入されます。例えば、AAV2カプシドの587番目と588番目の位置（可変領域VRIII内）は、多くのAAV2ベースのペプチドディスプレイライブラリーで好んで用いられる挿入部位です。ここへの挿入は、AAV2の主要な受容体であるヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）結合モチーフを消失させ、提示されたペプチドが細胞表面分子と効率的に相互作用することを可能にします。

Error-Prone PCR

Error-prone PCRは、標準的なPCR法を改変してカプシド遺伝子に変異を導入することで、多数のバリアントを含むAAVカプシドライブラリーを構築する、最も直接的なアプローチとなります。具体的には、低フィデリティ（低正確性）ポリメラーゼの使用、伸長時間の延長、Mg²⁺濃度の増加、Mn²⁺の添加、およびdNTP濃度の調整といった、あえて最適化を外したPCR条件を組み合わせることで、カプシド遺伝子にランダムな点変異を導入します。

DNAファミリーシャッフリング

DNAファミリーシャッフリングは、異なるAAVセロタイプ由来の親カプシド遺伝子を「分子交配」させることで、非常に効率的にキメラAAVカプシドを生成します。まず、多様なAAVセロタイプの親カプシド遺伝子を断片化し、次いでプライマーレスPCRによってこれらを再構築します。この過程で、部分的な配列の相同性に基づいて再結合が行われ、新規カプシドバリアントが形成されます。代替戦略として、合理的デザイン（AAV生物学の既知の知見に基づく改変）と指向性進化を組み合わせた「合成シャッフル」により、複雑度の高いライブラリーを作製することも可能です。このアプローチでは、天然AAVセロタイプの詳細な構造および配列解析に基づき、変異導入に適した部位をまず特定・評価します。その後、変異を含む断片を合成・組み立てて、新規カプシドバリアントを形成します。

In silico デザイン

AAVカプシドライブラリーのIn silicoデザインでは、コンピューターモデルによる予測により、AAVの性能向上に寄与する可能性のあるバリアント配列を導き出します。よく用いられる手法の一つに「祖先構築（ancestral reconstruction）」があります。これは、推定上の祖先AAVライブラリーをIn silicoでデザインし、実験的に検証することで、指向性が向上した強力な祖先カプシド配列を同定するものです。このアプローチの背景には、自然選択を生き抜いて現れた進化的中間体は、ウイルスの構造と機能を維持しつつ、ユニークな特性を備えている可能性が高いという考えに基づきます。また、機械学習も広く用いられており、計算アルゴリズムを適用して、仮想バリアントから増殖可能なウイルスが生成される可能性を予測します。機械学習アルゴリズムは、既存の入力データに大きく依存してタンパク質の構造と機能の関係を学習し、それをウイルスカプシドの組み立てといった複雑な生理学的プロセスの結果予測に応用します。

カプシドライブラリーのウイルスパッケージングは、以下に説明する1ステップまたは2ステップのプロセスで行うことができます。

カプシドライブラリーの1ステップパッケージング

カプシドライブラリーの2ステップパッケージング

AAVカプシドライブラリーからAAVを作製する従来の方法は、カプシドライブラリーとアデノウイルスヘルパープラスミドをパッケージング細胞に共トランスフェクションする1ステッププロセスです。広く用いられていますが、クロスパッケージング（ゲノムとカプシドの種類が一致しない粒子の生成）やカプシドモザイク現象（異なるゲノム由来のカプシドタンパク質が混ざった粒子の生成）といった欠点があります。これらの課題を克服するため、細胞1個あたりに導入されたライブラリープラスミド数が1コピー以下になるよう、細胞に対するプラスミドの比率を極めて低くしてトランスフェクションすることが推奨されます。

2ステップパッケージングでは、まずカプシドライブラリーと、ウイルスITRを欠いた野生型（WT）カプシド遺伝子をコードするヘルパープラスミドを共トランスフェクションします。これにより、WTカプシドが一部混ざったモザイクカプシドを持つAAV粒子（AAV転送シャトル）が生成されます。次に、これらの転送シャトルを、細胞1個あたり最大1粒子となるよう低いMOIでパッケージング細胞に導入し、さらにアデノウイルスを重感染（superinfection）させることで、最終的に高タイターなウイルスカプシドライブラリーを生成します。

ウイルスカプシドライブラリーは通常、スクリーニングの目的に応じて、in vitroまたはin vivoで数ラウンドのスクリーニングに供され、望ましい特性を持つキメラAAVが選択されます。

In vitro セレクション

In vivo セレクション

確立された細胞株を用いたAAVカプシドライブラリーのスクリーニングは、特に受容体標的能が変化したAAVバリアントを同定するために広く用いられる手法です。in vitroセレクションは迅速かつ技術的に容易ですが、いくつかの課題もあります。第一に、in vitroで高い形質導入効率を示したベクターが、in vivoで使用した際に同様の効率を再現できるとは限りません。第二に、in vitroで高い細胞特異性を示したAAVベクターが、in vivoでは非標的組織に感染する可能性があります。別種のin vitroセレクションとして、免疫回避特性を持つバリアントを同定するために、標的細胞に添加する前にライブラリーを免疫動物の強力な血清に曝露させる方法があります。しかし、AAVバリアントの免疫応答は、投与経路の違いによる免疫認識の差異など、さまざまな要因によってin vivoでの結果と異なる場合があります。

in vivo動物モデルは、培養が困難な細胞タイプや、複雑な組織構造内の特定の細胞タイプに感染可能なAAVバリアントを同定するための、より信頼性の高いスクリーニングプラットフォームを提供します。また、in vivoセレクションは、バリアントに関連する潜在的なオフターゲット効果を明らかにするのにも役立ちます。マウスと非ヒト霊長類（NHP）はどちらもin vivoスクリーニングに広く用いられていますが、NHPモデルはヒトとの類似性が高いため、改良されたAAVベクターのスクリーニングにおいて最も臨床的妥当性の高いプラットフォームとなります。

お客様の新規AAVカプシドについて、目的の特性を徹底的に評価・検証します。これには、組織指向性、導入効率、および潜在的なオフターゲット効果を評価するための、多種間でのAAV生体内分布プロファイリングなどが含まれます。また、当社のCliniVec™コンサルティングサービスを通じて、医薬品開発のポテンシャルを最大限に高めるために、AAVトランスファーベクターとパッケージングベクターの両方を同時に最適化することも可能です。

実験データ

高品質なプラスミドライブラリーの構築

Nucleotide composition of an (NNK)11 plasmid library(1).png

図1. (NNK)11ペプチドディスプレイAAVカプシドプラスミドライブラリーの塩基組成。NNK縮重コドン戦略を用いてライブラリーを構築した。各バーはDNA配列に沿った個々の塩基位置を表し、色は観察された塩基を示す。すべての位置で、理論値（N = 25% A + 25% T + 25% G + 25% C、K = 50% T + 50% G）に近い頻度で予想通りの塩基が観察された。

図2. ペプチドディスプレイAAVカプシドプラスミドライブラリーの7-mer可変領域におけるアミノ酸分布。NNK縮重コドン戦略を用いて構築。各バーは、特定のアミノ酸または終止コドンの理論的（青緑）または実測（ピンク）の割合を示す。全20種類のアミノ酸および終止コドンの観察頻度は、理論上の値と近似している。

信頼性の高いカプシドライブラリーのパッケージングプラットフォーム

Comparison of consistency across technical replicates.png

図3. 異なるプラットフォームを用いた同一AAVカプシドライブラリーのテクニカルリプリケート間におけるパッケージング再現性の比較（左：VB独自プラットフォーム、右：従来法）。VB独自プラットフォームではリプリケート間で強い相関（r = 0.70）が認められ、高い再現性が示された。対照的に、従来法では相関が乏しく（r = 0.02）、パッケージング中の確率的事象が効率を低下させている可能性が示された。

in vivoスクリーニングにおける高い再現性

Comparison of consistency across technical replicates.png

図4. 個体間におけるin vivo AAVカプシドライブラリースクリーニング結果の高い相関性。(A) AAVカプシドライブラリーを網膜下投与し、RNAseqを実施。異なるマウスの網膜におけるバリアントのリードカウントを比較した結果、強い相関（r = 0.88）を示した。(B) AAVカプシドライブラリーを尾静脈投与し、DNAseqを実施。異なるマウスの肝臓におけるリードカウントを比較した結果、強い相関（r = 0.93）を示した。これらの結果は、当社のin vivoスクリーニングプラットフォームが新規AAVカプシドの探索において極めて信頼性が高いことを示している。

VectorBuilderのプレシジョンカプシド

VectorBuilderの革新的なカプシド技術は、強力なソリューションを提供します。標的特異性を高め、遺伝子導入パフォーマンスを最大化した改変カプシドは、より安全で、効果的かつ効率的なAAVベースの治療を可能にします。

脳

血液脳関門（blood-brain barrier: BBB）を高効率で突破し、最大限の標的送達を達成するために最適化されています。

特長

全身投与
血液脳関門を効率的に通過
BALB/cおよびC57BL/6マウスモデルで検証済み
肝臓における標的外発現の大幅な低減

眼科領域

当社の眼カプシドは、網膜色素上皮 (RPE) で極めて高い導入効率を実現するとともに、網膜全体への優れた浸透性・周辺拡散性を示します。

特長

硝子体投与
網膜全層にわたる優れた浸透性と導入効率。RPE（網膜色素上皮）での実績は特に優る
霊長類（NHP）で検証済み

筋組織

VectorBuilder の新規カプシドは、骨格筋、心筋、横隔膜筋に対する標的特異性と導入効率を飛躍的に向上させます。

特長

全身投与
筋肉における導入効率の向上
オフターゲット発現の最小化

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リソース

Q&A

AAVカプシドライブラリーの構築方法にはどのような違いがあるか？

手法	概要	メリット	デメリット
ランダムペプチドディスプレイ	通常7～9個のアミノ酸からなるランダムなペプチド配列を、AAVカプシドの特定部位に挿入する。	実施の簡便さ新規機能の発見	免疫原性に関する潜在的な懸念
Error-Prone PCR	非最適なPCR条件を用いることで、AAVカプシド遺伝子にランダムな点変異を導入する。	直接的に極めて多様なAAVカプシドライブラリーを構築	機能的多様性が得られる可能性が低い
DNAファミリーシャッフリング	関連するAAVセロタイプ由来の遺伝物質をシャッフルし、キメラカプシドを作製する。	AAVファミリーの自然的多様性を活用機能的多様性が得られる可能性が高い	労力と時間を要する AAVファミリーの類縁関係に関する知識が必要
In silico デザイン	コンピューターを用いた計算手法により、AAVカプシドバリアントを予測・デザインする。	特定の機能の標的化における精密さ時間とコスト効率に優れたin silicoスクリーニング	予測精度に限界がある正確な構造データに依存

AAVカプシドスクリーニングの読み出しとして、RNA-seqとDNA-seqを使用する場合のメリット・デメリットは何か？

	RNA-seq	DNA-seq
メリット	細胞外AAVに起因する偽陽性シグナルがない DNAからRNA転写による増幅効果に伴う高い感度必要な組織量が少ない組織特異的プロモーターの使用により、標的組織から正確なmRNAの回収が可能	ウイルス粒子の細胞内侵入の成功の直接的示唆標的組織でのプロモーター活性に依存しない
デメリット	NGSライブラリー調製工程の増加標的組織でプロモーターが機能しない場合には不向き	細胞外AAVによるシグナル混入の可能性感度が比較的低い