レンチウイルス CoV S-protein シュードタイプ

ベクタービルダーでは、コロナウイルス研究用に、コロナウイルスのスパイク (Spike: S) タンパク質エンベロープを持つCoV S-protein シュードタイプ レンチウイルスを受託作製いたします。

ウイルスの宿主上皮細胞への感染サイクルの最初のステップは、ウイルスの宿主細胞表面への吸着と侵入です。吸着のステップは、ウイルス表面に存在する特異的受容体が、宿主細胞膜の相補的受容体に結合することで発生します。コロナウイルスの細胞侵入および宿主生物種を限定する指向性の進化メカニズムを理解するためには、異なるコロナウイルス種のSタンパク質と宿主受容体との相互作用を理解することが必須です。しかし、技術的にも法的にも取り扱いが困難なバイオセイフティレベル3(BSL-3)施設を必要とするSARS-CoVなど危険なウイルス種の場合、生きたウイルスの産生および取り扱いは研究を進める上で大きな障害となり、研究者へのリスクも高くなります。

コロナウイルスの宿主細胞への感染メカニズム研究にレンチウイルスのシュードタイプ化を使用

代替方法としてコロナウイルスのSタンパク質を外套させたシュードタイプレンチウイルスを利用し、生きたコロナウイルスを扱うことなくコロナウイルスの細胞侵入のメカニズムを研究する方法が提案されます。コロナウイルスとレンチウイルスは、ともに外層が脂質二重膜からなるエンベロープウイルスで、吸着する宿主・組織特異性を決める受容体タンパク質が外界に向かって突出した形状を取っています。シュードタイプレンチウイルスのパッケージングの際、通常の水泡性口炎ウイルスのGタンパク質(VSV-G)エンベロープの代わりに、コロナウイルスのSタンパク質をウイルス産生細胞の細胞表面に高発現させ、ウイルス粒子を産生させます。このように作成されたシュードタイプ(偽型)レンチウイルスは、ウイルス表面に提示されたSタンパク質と宿主細胞の受容体との結合を介して宿主細胞に侵入するメカニズムを模倣しています。さらにSタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、受容体との相互作用や中和抗体検出系の解析などにも応用できます。シュードタイプレンチウイルスは、バイオセイフティー基準を満たした安全な取り扱い下で研究を行うことが可能となっています。

コロナウイルスは、宿主・組織特異的な指向性を持つウイルスとして大きな一群を形成しています(図1)。1種のコロナウイルスが効果的に感染できる生物種は1種のみ、あるいは2-3種に限定されています。この指向性は、その名前の由来ともなっているように王冠(コロナ:ギリシャ語で王冠を意味する)様の外観を提示するスパイク(Spike: S)タンパク質と宿主細胞表面の受容体の結合で説明されています。例えば、SARS発症ウイルスのSARS-CoV、およびCOVID-19発症ウイルスのSARS-CoV-2は、ヒト呼吸器、肺、および口腔上皮細胞表面上に存在するアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)にSタンパク質が結合することによりヒトに感染します。一方、MERS-CoVは、ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP-4)受容体への結合を介してヒトに感染します。

ベクタービルダーは、コロナウイルスのSタンパク質エンベロープを持ったシュードタイプレンチウイルスをready-to-useの状態で納品いたします。レンチウイルスパッケージングは、エンベローププラスミド (CoV S-protein)、パッケージングプラスミドDNA (GAG-POL, REV)、そしてトランスファープラスミド(カスタムデザイン: 5'LTR-promoter-GOI-3'LTR)の3種類のプラスミドをウイルス産生細胞に共トランスフェクトしてウイルス粒子を産生します。トランスファープラスミドに、EGFPやルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子をクローニングすることで、レンチウイルスの宿主細胞への侵入をライブ検証し、モノクローナル抗体や侵入阻害剤の迅速なスクリーニング用ツールの開発も可能です。

ここをクリックして実験による検証を読む

価格と作業日数
サイズ 推奨使用系 最小タイター 容量 価格 (消費税・送料別) 作業日数
パイロット 培養細胞 >10TU/ml 250 ul (10x25 ul) 78,000円 10-20 日
中容量 1 ml (10x100 ul) 130,000円
大容量 >10TU/ml 1 ml (10x100 ul) 208,000円
超純粋中容量 培養細胞 & in vivo >10TU/ml 500 ul (10x50 ul) 260,000円
超純粋大容量 1 ml (10x100 ul) 325,000円

TU = 形質導入ユニット (または感染ユニット)

レンチウイルス トランスファープラスミドの種類

トランスファープラスミドのデザインは下のベクターピッカーよりレポーターとマーカーのご選択方式で簡単デザインも行えます:

シュードタイプ化に使用されているレンチウイルスベクターのマップ

カスタムデザインのトランスファープラスミドやエンベローププラスミドの受託構築もお受けしています。カスタムデザインとウイルスパッケージングは次のリンクよりご依頼ください:

オンラインデザインツールを使ってトランスファーベクターをデザインする
エンベローププラスミドのデザインとカスタムレンチウイルスパッケージングの受託サービスを依頼する
スパイク (Spike: S) タンパク質の種類

コロナウイルスは自然界に非常に多種類が存在し、巨大なウイルス群を構成しています。事実上、全ての哺乳動物と鳥類に感染することが明らかになっています。何百ものコロナウイルス種が同定されていますが、その中でも特に、ヒト、家畜、ペット、モデル動物に感染性のある数十種、およびその近縁種が重要であると考えられています。

主要なコロナウイルス種の系統樹

これらのコロナウイルス種についての詳細は、下の表を参考にしてください:

主要なコロナウイルス種リスト

VectorBuilderは、上記のコロナウイルス種のSタンパク質を使ってレンチウイルスのシュードタイプ化受託サービスを提供します。 この表にないコロナウイルス種のSタンパク質でのシュードタイプ化にも対応しますので、お問合せください。

SARS-Cov-2 Sタンパク質については、次の変異型Sタンパク質でのシュードタイプ化も対応しています:

現在提供している
SARS-CoV-2 S タンパク質変異型のリスト

ネガティブコントロールにはウイルスエンベロープタンパク質を欠くBald(禿)レンチウイルスをお使いください。

実験による検証

ベクタービルダーは、独自の手法を開発し、シュードタイプ化のプロトコールを最適化しました。その結果、最適化ウイルスは、オープンになっているプロトコールを使用して作成した場合に比較して、はるかに高い形質導入効率を示します。SARS-CoV-2Sタンパク質およびD614G変異Sタンパク質でシュードタイプ化したレンチウイルスは、ヒトACE2受容体を高レベルで発現する293T細胞に対して高い形質導入効率を得られるが、ACE2はしな、または発現レベルが低い293T細胞では、形質導入ができないことを示しました。 以下に蛍光レポーターの形質導入実験(図 1) とルシフェレースアッセイ(図 4)の結果を示します。 したがって、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはVSV-Gシュードタイプウイルスによる形質導入用には、弊社で樹立したACE2発現細胞株の使用をお勧めします。

コロナウイルス研究用培養細胞モデルを表示する

以下に、形質導入テスト (図 1- 3)、ルシフェレースアッセイ (図 4) そしてウエスタンブロッティング (図 5)の結果を示します。

293T cell line transduced with SARS-CoV-2 S protein

図1. SARS-CoV-2 Sタンパク質シュードタイプレンチウイルスをヒトACE2受容体を過剰発現した293T細胞に感染させた。形質導入後72時間の細胞を撮影。  

 

293T (hACE2) cells transduced with lentivirus pseudotyped with N439K or N501Y S protein

図 2. 293T (hACE2)細胞に、N439KまたはN501Y Sタンパク質でシュードタイプ化したレンチウイルスを感染させ、形質導入を検証した。

 

293T (hACE2) cells transduced with lentivirus pseudotyped with B.1.1.7 or B.1.351 S protein

図 3. 293T (hACE2)細胞に B.1.1.7 または B.1.351 Sタンパク質でシュードタイプ化したレンチウイルスを感染させ、形質導入を検証した。

 

図 4. 異なるエンベロープタンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルスを使って、293T(hACE2)細胞に形質導入を行った。カラム 1: 形質導入を行わないネガティブコントロール、カラム 2: SARS-CoV-2 S タンパク質、カラム 3: SARS-CoV-2 S タンパク質D614G変異型、カラム 4: VSV-Gタンパク質。

        

図 5. SARS-CoV-2 Sタンパク質のS2ドメインに対する抗体を使用したウエスタンブロット。パッケージング細胞およびシュードタイプウイルスにSタンパク質の全長および切断されたS2の両方が存在することが示された。 注: Sタンパク質は感染した細胞へのウイルス侵入を促進するために自然に切断されます。レーン 1: MWマーカー. レーン 2: 形質導入無しのコントロール 293T細胞. レーン 3:VSV-Gタンパク質シュードタイプレンチウイルス作製のパッケージングプラスミドをトランスフェクトした293T細胞. レーン 4: Sタンパク質のヘルパープラスミドのみをトランフェクトした293T細胞. レーン 5: Sタンパク質シュードタイプレンチウイルスのパッケージングプラスミドをトランスフェクトした293T細胞. レーン 6: VSV-Gシュードタイプレンチウイルス粒子. レーン 7: S タンパク質シュードタイプレンチウイルス粒子.

レンチウイルスCoV Sタンパク質 シュードタイプの受託注文の方法は?

以下のリンクよりご依頼いただけます:

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バイオセイフティーに関してのご注意

組み換えレンチウイルスを用いる研究は、所属機関の組み換えDNA実験安全委員会の指示に従い、研究目的に相当するバイオセイフティー基準を満たし、各担当省庁のカルタヘナ法指針に基づいて拡散防止措置を取り、トレーニングを受けた研究員がPPEで保護をしたうえで安全に十分注意して実施してください。様々なコロナウイルス種に対してのバイオセイフティーのガイドラインは、 American Biological Safety Association (ABSA)より発行されている、 Risk Group Database よりご確認ください。またはNIHのInterim Laboratory Biosafety Guidance for Research with SARS-CoV-2 を参考にしてください。日本でのSARS-CoV-2関連遺伝子を使った研究に関する規制詳細は研究を実施するユーザーより担当省庁にご確認いただき、組み換えDNA実験の法令を遵守してください。SARS-CoV-2に関する文部科学省管轄では、研究開発二種告示、別表第2に新型コロナウイルスが追加され、大臣確認申請は不要になりました。ただし、別表第一第一号イ以外の項に該当する場合は大臣確認申請が必要です。拡散防止区分の変更や新たな大臣確認申請が必要となる場合があるかもしれないため、文部科学省の告示なども確認ください。拡散防止措置有効性のリンクも示します。経産省の産業二種使用のリンクはこちらです。

納品物
  • カスタムレンチウイルス CoV S-protein シュードタイプ
  • カルタヘナ法26条1項情報公開書類(メール添付)
  • ウイルス品質試験証明書(COA)
関連印刷物

フライヤー(チラシ):