細菌ゲノム編集

λ-Red recombinationシステムは細菌のゲノム編集で広く用いられている手法です。λバクテリオファージ由来のこのシステムは、外来DNA断片と宿主ゲノム間での相同組換えを著しく促進します。λ-Red recombinationシステムは3つの主要なコンポーネントで構成されており、それらが協働して相同組換えを促進します(図2)。

図2. λ-Red recombinationシステムの主要コンポーネント。Exo (5’ to 3’ エキソヌクレアーゼ) はDNA二本鎖 (dsDNA) を消化する。Beta (一本鎖DNA(ssDNA) 結合タンパク質) はDNAのアニーリングを促進させる。Gam は導入した線状DNA断片が宿主細胞由来のヌクレアーゼによって分解されることを防ぐ。

λ-Red遺伝子は通常、ドナーDNAの導入前に発現させます。そのためにλ-Redシステムのコンポーネントをコードするプラスミドが用いられます。また、λ-Red遺伝子の安定発現細菌株も組換え操作に広く用いられています。目的の遺伝子改変を含むドナーDNA（鋳型）は、直鎖二本鎖DNA（dsDNA）または一本鎖DNA（ssDNA）として細菌細胞に導入します。この鋳型には、抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーが含まれていることが多いです。λ-Redタンパク質 ― Exo、Beta、Gam ― は、ドナーDNAと標的配列間の相同組換えを促進します。組換え後、一般的には薬剤選択とコロニーPCRを組み合わせた方法などで目的とするゲノム編集細胞を単離します。

CRISPR-Cas9は、細菌を含む様々な生物で使用されている汎用性の高いゲノム編集ツールです。大腸菌など多くの細菌種では、非相同末端接合（NHEJ）修復経路の効率が低いため、CRISPRによって誘導される二本鎖切断（DSB）は細胞死を引き起こします。この特徴により、CRISPRは選択マーカーを追加することなく、強力なカウンターセレクション（逆選択法）として利用することができます。

図3. CRISPR-Cas9システムを用いた点変異導入の模式図。まず、Cas9とリコンビナーゼをコードするプラスミドを細菌細胞に導入し、λ-Redタンパク質の発現を誘導する。その後、gRNAプラスミドとドナーDNAをCas9とリコンビナーゼを発現する細胞に導入する。相同組換えが完了しなかった場合は、Cas9によって引き起こされた二重鎖切断（DSB）は修復されず、細菌細胞は死滅する（右）。一方で、細菌細胞はドナーDNAと標的ゲノム配列の間で相同組換えが完了した場合のみ生存できるため、目的のゲノム編集細菌株が得られる（左）。

致死プラスミドは、目的の遺伝子改変配列を含み、耐性のある宿主内または特定の条件下でのみ複製されるようにデザインされています。逆選択が可能なマーカー（例: スクロース感受性を付与するsacB遺伝子）や条件付き複製システム（例: 温度感受性複製起点）などのメカニズムを利用します。

図4. 温度感受性複製起点を持つ致死プラスミドを用いた遺伝子ノックインの模式図。相同組換えにより、目的遺伝子（GOI）と選択マーカーが標的遺伝子座に組み込まれる。抗生物質でコロニーを選択した後、プラスミドの複製を防ぐために非許容温度で培養する。2回目の組換えにより、安定したノックイン（バックボーンの除去）または元のゲノム配列への復帰が起こる。目的のノックインが入ったコロニーを選択後、PCRで確認する。

図5. CRISPR-Cas9による大腸菌の遺伝子編集。(A）CRISPR-Cas9システムとλ Redタンパク質の導入を用いた、大腸菌ゲノムにおける配列欠損。(B) 標的領域のPCRで、未編集細胞では予想サイズ約3900bpの増幅断片が確認されたが（レーン1）、CRISPRを用いたノックアウトにより欠失が生じた細胞では、増幅断片サイズは約1800bpとなり（レーン2）、目的の約2100bpの欠失が確認された。