CRISPR IVT RNA

CRISPR-Cas9は、プラスミド、組換えウイルス、gRNA-Cas9 RNP複合体、gRNAとCas9 IVT mRNAの混合物など、様々な方法で導入することができます。これらの方法にはそれぞれ利点と限界があり、オフターゲットや望ましくない影響を最小限に抑えながら最大の効率を得るために、目的に合わせた方法を選択することができます。その中でもIVT RNAが最も有望なアプローチの一つとして急浮上しています。

プラスミドは一般に、安価に大量に生成するのが最も簡単で、化学的トランスフェクションやエレクトロポレーションによって導入することができ、扱いもまた簡単です。しかし、その導入方法から、in vitroでの応用に限定されています。加えて、プラスミドによるトランスフェクション効率は細胞の種類によって大きく異なり、発現は細胞種特異的なプロモーター活性に依存するため、特定の系ではその効率が妨げられることがあります。その結果、プラスミドは高活性プロモーターを使用する傾向があり、Cas9の高発現レベルにつながり、オフターゲット編集や宿主ゲノムへのプラスミドDNAのランダム挿入を増加させる可能性があります。

組換えウイルスは、トランスフェクションが困難な細胞に使用でき、Cas9を安定的に発現する細胞株を樹立して、複数のgRNA実験に使用できるため、一般的に使用されるもう一つのCRISPR-Cas9導入方法です。しかしながら、このシステムには、細胞タイプに依存するプロモーター特異性や、長時間のCas9発現によるオフターゲット効果のリスク上昇など、プラスミドによる導入と同様に多くの制限条件があります。さらに、特にCas9遺伝子をゲノムに挿入するレトロウイルスおよびレンチウイルスシステムにおいては、挿入による突然変異誘発リスクが高くなります。

gRNA-Cas9 RNP複合体による導入は、プラスミドや組換えウイルスシステムの制限の多くを回避し、転写も翻訳も必要ないため、迅速な編集を可能にします。しかしながら、この方法は効率的な導入のためにエレクトロポレーションを必要とするため、in vitroのみの使用に大きく制限されます。この方法による編集は急速に行われ、Cas9が宿主細胞内で分解されてすぐに停止するため、Cas9タンパク質の持続性によっても制限されます。

上記の方法とは対照的に、gRNAとCas9 IVT mRNAの混合物の導入は、オフターゲット効果を最小限に抑えたゲノム編集のための最も効率的な方法の一つとして急速に台頭してきました。gRNAとCas9 IVT mRNAは、脂質ナノ粒子または化学的トランスフェクション試薬に共カプセル化して一緒に送達することができるため、ゲノムへの挿入リスクなしにin vitroとin vivoの両方のアプリケーションに適したシステムとなります。さらに、転写を必要としないため、細胞種特異的なプロモーター活性に依存しない発現が可能であり、翻訳も比較的短時間で行われるため、迅速かつ効率的な編集が可能です。gRNA-Cas9 RNP複合体と比較して、mRNAはCas9の発現をより長く維持でき、編集の持続時間を延ばします。mRNAは最終的に分解され、編集は一過性にしか起こらないため、オフターゲット効果は制限できます。

要約すると、プラスミド、組換えウイルス、およびgRNA-Cas9 RNP複合体を介したCRISPR-Cas9コンポーネントの導入方法には、多くの応用用途に使用するにはまだ様々な制限があり、さらに、限定的な効率、オフターゲットリスク、および挿入突然変異誘発の可能性などの問題が残されています。一方、gRNAとCas9 IVT mRNAの混合物による送達は、その多くの利点と制限が少ないという点でゲノム編集の最も効率的な方法の一つとして浮上しており、ゲノム編集を始める際に考慮すべき手法です。