RNAおよびLNP製造

図4. UTR最適化によるmRNA発現の改善。様々な5'UTRと3'UTRの組み合わせによる、in vitroでガウシアルシフェラーゼ発現への影響を検証した。HEK293T細胞を12ウェルプレートに2.3x10⁵細胞/ウェル密度で播種し、1ウェルあたり1 μgのmRNAをトランスフェクションした。トランスフェクション後6，24、48、72、96時間で、培養液中のガウシアルシフェラーゼ活性を測定した。

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図5. miR-122標的部位を3‘UTRに組み込むと、IVT mRNAの肝臓特異的発現が減少する。 マウスにHiExpress™ホタルルシフェラーゼLNP-mRNAを静脈注射（i.v.）で10 ug 投与し、3‘UTR内のmiR-122標的部位の有無、およびmiR-122標的部位の挿入位置が異なる2つのデザイン（デザインA、B）による違いを検討した。投与6時間後にマウスの臓器の発光測定を行った。miR-122は肝臓で特異的に高発現しており、miR-122標的部位が3’UTRに存在すると肝臓でのIVT mRNA発現が減少した。

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図6. IVT mRNAのコドン最適化によるin vitroおよびin vivoでの遺伝子発現の向上。 (A）HEK293T細胞におけるHiExpress™ ホタルルシフェラーゼmRNAおよび他のルシフェラーゼmRNAの発現。12ウェルプレーで培養中の細胞を、1ウェルあたり0.5ugのmRNAでトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を6、24、48、72時間後に測定した。(B）成体C57BL/6マウスに30ugのLNP-mRNAを筋肉内注射し、6、24、48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。FLuc WTは野生型ホタルルシフェラーゼ、FLuc WT（co）はコドン最適化された野生型ホタルルシフェラーゼ、FLuc2はLuc2ホタルルシフェラーゼを示す。

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HiExpress™ ホタルルシフェラーゼ LNP-mRNAを試す 

図7. PolyAテールのサイズ解析。 リボヌクレアーゼT1を用いてIVT mRNAから PolyAテールを切断し、オリゴdTアフィニティークロマトグラフィーで単離した。(A) 単離した PolyAテールのUrea-PAGEゲル電気泳動による解析。(B) 単離した PolyAテールのLC-MSによる解析。期待されるサイズが120 ntの PolyAテール120 pmolからデコンボリューションスペクトルを作成した。(C) 期待されるサイズが120 nt PolyAテールのサイズ分布。エラーバーはtriplicateの標準偏差を示す。加重平均長は123 nt。

図8. 翻訳効率に対するPolyA長および構造の影響。 同じCap1とUTRを持つが、様々なPolyAテール長を持つIVT EGFP mRNAをHEK293T細胞にトランスフェクションした。

図9. 修飾ヌクレオチドによる遺伝子発現の向上とdsRNA不純物の低減。 (A) HEK293T細胞におけるホタルルシフェラーゼの発現。修飾ヌクレオチド（N1-メチルシュードウリジン：m1Ψ、および5-メチルシトシン：m5C）の有り/無しのmRNAを合成した。12ウェルプレートで培養した細胞に、1ウェルあたり1 μgのmRNAをトランスフェクションした。トランスフェクション後6、24、48時間におけるHEK293T細胞内のルシフェラーゼ活性を測定した。エラーバーは標準偏差を示す。(B) ヌクレオチド修飾（m1Ψ）有り/無しのEGFP IVT mRNAを磁気ビーズ精製後、等量（1ドットあたり750 ng）をドットブロットアッセイによりdsRNA不純物について評価した。

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図10. 10,000 ntを超えるIVT RNAの安定性が高いことを示す変性アガロース電気泳動像

図11. LC-MSにより解析したIVT mRNAのキャッピング効率。(A) 共転写法（co-transcriptional）または(B) 酵素法のいずれを用いても、高効率なキャッピングが達成可能。

二本鎖RNA（dsRNA）はIVTの副産物であり、望ましくない免疫原性を引き起こす主な要因となります。ドットブロットの結果は、極めて低レベルのdsRNAに抑えた超高純度スケールを達成するためには、精製工程（例：IP-RP）の追加が必要となる場合があることを示しています。

図12. 各種精製プロセスの違いによるdsRNA除去効率。異なる方法で精製したhSpCas9 IVT mRNAの等量（1ドットあたり1500 ng）をドットブロットアッセイにより評価し、dsRNA不純物を推定した。略称：HIC（疎水性相互作用クロマトグラフィー）、IP-RP（イオンペア逆相液体クロマトグラフィー）

図13. 表示された濃度のRNase A存在下でインキュベートした後の、前駆体および環状EGFP RNA（circRNA-EGFP）のゲル電気泳動解析。RNase Aはすべての線状RNAを分解するが、環状RNAは分解しない。

図14. LNP-mRNAのクライオ電子顕微鏡（Cryo-TEM）画像。スケールバー＝100 nm

図15. 粒子径およびゼータ電位分布の解析。PDI (A) およびゼータ電位 (B) は、粒子の運動による散乱光の強度変化を測定するDLS（動的光散乱法）により算出した。データはLNP混合物が均一であることを示している。

図16. 抗CD31抗体標識LNP-mRNAの長期凍結保存による影響（153日間）。(A）ホタルルシフェラーゼ（FLuc）発現LNP-カプセル化mRNAを、 無添加溶液／4℃、および7.5%スクロース溶液 ／-80℃の2通りの条件で保存した。両群の粒子サイズ（ピンク棒グラフ）とPDI（濃いシアンの点）を元のパラメーターと比較した。(B) 投与6時間後のFluc mRNA発現画像。ICRマウス（雌）に、PBS、無添加／4℃で保存したLNP、または7.5％スクロース溶液／-80℃で保存したLNPを静脈注射した。(C) 凍結保存後のLNP-mRNAのカプセル化効率。調整直後のFLuc LNP-mRNAをコントロールとして用いた。(D) 凍結保存後のRNAの完全性の比較。以上のデータより、抗体結合LNP-mRNAを7.5%スクロース溶液／-80℃で保存すると、粒子の均一性、カプセル化効率、mRNA発現が十分に維持され、長期保存が可能であることを示している。

図18. LNPを用いたin vitroでの効率的なmRNAデリバリー。LNPカプセル化EGFP mRNA、または市販のトランスフェクション試薬と混合したEGFP mRNAを細胞にトランスフェクションした。(A) Jurkat細胞およびHEK293T細胞におけるEGFP発現のフローサイトメトリー解析、および (B) トランスフェクション24時間後のHEK293T細胞の蛍光画像。MFI：中央蛍光強度。