既製品CRISPRライブラリー

デュアルgRNAライブラリーは、シングルgRNAライブラリーよりもはるかに強力なノックアウトスクリーンが可能です。なぜなら、デュアルgRNAライブラリーは標的配列に大きな配列欠失を導入できるため、機能喪失突然変異の発生効率がはるかに高いからです。デュアルgRNAライブラリーの各CRISPRベクターには、同じ遺伝子を標的とする一対のgRNAが含まれます。デュアルgRNAライブラリーがCas9を発現する細胞に導入されると、各ベクターは同じ標的遺伝子に2つの切断を作り出し、細胞が2つの切断部位の壊れた末端を修復しようとすると、2つの標的部位にまたがる大きな欠失が生じます。Cas9/gRNAによる２つの切断部位は、標的遺伝子の機能的に重要な領域を挟むようにデザインされているので、この2つの部位にまたがる欠失は遺伝子機能の喪失につながる可能性が高まります。

典型的なノックアウトスクリーニングの場合、プール型CRISPRライブラリーは1ベクターシステムまたは2ベクターシステムのどちらの形式でも構築できます。1ベクターシステムではCas9またはCas9バリアントは同じベクターからgRNA（複数可）と共発現されます。2ベクターシステムではCas9またはCas9バリアントとgRNA（複数可）は2つの別々のベクターから発現されます。2ベクターシステムでは、gRNA発現ベクターをCas9安定的発現する細胞株に導入するオプションも選択できます。1ベクターシステムの利点は、細胞への2つの異なるベクターの共導入／トランスダクションを回避できること、およびCas9発現安定細胞株の入手可能性に制限されないことです。しかし、2ベクターシステムに比べると汎用性が低く、クローニングやウイルスパッケージングの効率が劣ることがあります。

ベクタービルダーはgRNA特異性スコアの計算にCRISPRライブラリーデザイン（CLD）のアルゴリズム を使用しています。 ある生物のN(20)NGG配列を標的とするgRNAを例にとると、ゲノム内で標的配列と3つ以下のミスマッチを持つ潜在的なオフターゲット配列すべてを検索します。次にそれぞれの潜在的なオフターゲット配列について、オフターゲットスコアが計算されます。すべてのオフターゲットスコアを集計して最終的なgRNAの特異性スコアを算出します（0から100までで数字が大きいほど高い特異性を示す）。 特異性スコアは大まかな指標に過ぎないことに留意してください。実際の効率性や特異性はスコアが予測するものとは異なる可能性があります。スコアの低いgRNAでもうまく機能することもあります。