CRISPR mRNA
CRISPRを用いたゲノム編集は、標的配列に対して迅速かつ高効率に変異を導入できる手法として広く利用されています。VectorBuilderでは、様々な検証を実施し、in vitroで高発現する様々なCRISPR mRNA製品をご提供しています。
製品情報 プライスマッチ
HiExpress™ hSpCas9
hSpCas9
HiExpress™ ABE mRNA
当社のコドン最適化されたHiExpress™ hSpCas9 IVT mRNAは、in vitroで一貫して高発現を実現します。
VectorBuilderのhSpCas9 IVT mRNAは、修飾ヌクレオチドN1-メチルシュードウリジン（m1Ψ）を含むタイプと含まないタイプのいずれかを選択可能です。細胞培養系において、そのゲノム編集機能は実証済みです。
ABE（adenine base editor; アデニン塩基編集酵素）は、CRISPR/Cas9とアデニンデアミナーゼを基に開発された次世代のゲノム編集ツールです。HiExpress™ ABE IVT mRNAは、ABE7.10をベースにコドン最適化されており、in vitroで高発現するよう設計されています。
出荷形態と保存方法
IVT mRNA製品は、1 mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.4）中に保存され、-80°Cで最大12ヶ月間保存することができます。製品はドライアイスで出荷され、凍結融解の繰り返しは避けてください。
実験による検証
- HiExpress™ hSpCas9
- hSpCas9
- HiExpress™ ABE mRNA
図1. VectorBuilderが開発したHiExpress™ hSpCas9 IVT mRNAは高い発現レベルと編集効率を示す。(A) ウエスタンブロット解析および (B) HEK293T細胞におけるCas9発現量の定量（hSpCas9を基準として正規化）。1 µgのhSpCas9 IVT mRNA、コドン最適化済みHiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA、または未処理コントロール（NC）をトランスフェクションして24時間後に解析。(C) HEK293T細胞にgRNA（1 µg）および指定量のhSpCas9またはHiExpress™ hSpCas9 IVT mRNAをトランスフェクション後、24時間でT7E1アッセイを実施した。青い星は未切断のPCR産物、ピンクの矢印はT7E1により生成された断片を示す。
図2. hSpCas9 mRNAのin vitroにおける機能検証。(A) 2種類のEGFP標的gRNAを用いて、IVT Cas9 mRNAと共に293T-EGFP細胞にトランスフェクション。未処理コントロール（NC）またはトランスフェクションした細胞におけるEGFP発現を顕微鏡で観察(B)、またEGFP発現量をフローサイトメトリーで定量した(C + D)。(E + F) EGFP遺伝子の編集は、T7E1アッセイおよびサンガーシークエンシングによってさらに確認した。
図3. HiExpress™ ABE7.10 mRNAのin vitroでの機能検証。ABE7.10 mRNAとHiExpress™ ABE7.10 mRNAを、同一のgRNAとともにHEK293T細胞へ共トランスフェクションした。48時間後にゲノムDNAを抽出し、標的領域をPCRで増幅し、NGSで解析した。点線の枠で示された編集ウィンドウ内にてA→G編集（＊）が検出された。HiExpress™ ABE7.10 mRNAは、5番目のヌクレオチドにおいて97.7%という高い編集効率を示し、従来のmRNAによる編集効率30.1%を大きく上回った。
