プリメイド IVT mRNA

ベクタービルダーのプリメイド IVT mRNAは、in vitro実験や in vivo実験で高レベル発現が検証済のmRNAです。デリバリー効率の検証や、カスタムIVT mRNA実験のコントロールとして使用できます。カスタムmRNA合成と遺伝子デリバリーについてはmRNA遺伝子デリバリーソリューションズをご覧ください。

特徴
  • mRNAにCap1や検証済みの5’UTR&3’UTRを付加している。N1-Methylpseudouridine (m1Ψ)などの修飾ヌクレオチドを取り込ませることも可能(お問い合わせください)。
  • 高発現を可能にする当社の最適化配列でデザインされたHiExpress™ Firefly/Guassia ルシフェラーゼmRNA
  • 配列検証、インテグリティ、純度、発現検証など、包括的な品質管理がなされている

製品情報

発送条件と保存方法

mRNA製品は1mMクエン酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.4) にて保存されています。mRNA製品はドライアイスで凍結出荷され、-80°Cで12ヶ月まで安定して保存できます。品質の低下を予防するために、凍結融解の繰り返しは避けてください。

技術的情報

mRNA製造過程と品質検査のワークフロー

図 1.  in vitro 転写からの一般的なmRNA合成のワークフロー

当社のmRNA製造のワークフローは、まずデザインとテンプレートDNAの合成から始まります。ベクターデザインでは、最適コドンの選択、GC含量の調整、RNA2次構造の熱力学的安定性などを考慮してデザインされ、in vitro転写ベクターにクローニングします。次にプラスミドDNAは精製され、検証され、リニア化されます。リニア化されたDNAからin vitro 転写反応を行い、目的のmRNAを製造します。in vivo翻訳を向上させ、免疫原性を低下させる目的で、in vitro転写反応に修飾ヌクレオチドを取り込ませることも可能です。高効率なキャップ付加(>95%) は、共転写または酵素反応によって行います。転写されたmRNAはmRNA-結合ビーズを使って精製し、さらに品質検査を実施し、検査に合格したmRNAを納品します。

関連技術情報
化学物質等安全データシート (MSDS) 品質検査証明書 (Certificate of Analysis, COA) ユーザーインストラクション カタログとフライヤー

Q&A

mRNA capと capping methodの違いは何でしょうか?

Cap 0 は 真核生物mRNAsの 5’ 末端に 5’ から 5’ 三リン酸結合によってN7-methylguanosine (m7G) が付加されます。この修飾はいくつもの酵素反応を介して転写と共に行われ、核輸送や転写物の安定性、真核生物翻訳開始因子(eukaryotic translation initiation factor:eIF4E)による認識を促進します。Cap 1はm7G capに加えて、転写されたmRNAの最初のヌクレオチドの2’Oにメチル基を付加することを示します。哺乳類細胞ではcap1構造はmRNAが自身のものであると認識する上で重要であり、自然免疫系に標的とされないために必要です。Cap 1構造を合成mRNAに付加することにより、in vivoにおけるmRNAの発現増強と免疫原性を抑制できることが示されています。in vitro転写RNAへのキャッピングは転写をキャップアナログを使用して行うか、転写後に酵素反応によって行うことが可能です。弊社のキャッピング方法はLC-MSを用いた検証で効率も検証されています。

なぜ修飾ヌクレオチドの取り込みを検討するのでしょうか?またどの修飾を使うとよいでしょうか?

細胞は細胞質とエンドソームにRNAレセプターを持っているため、外来のRNAがレセプターによって認識されると免疫反応が活性化します。修飾ヌクレオチドは内因性RNAに共通して検出される構造です。そこで、特定の修飾ヌクレオチドを合成mRNAに取り込ませることにより、免疫原性を抑制することができます。またシークエンスを工夫するkとおで、mRNAの2次構造を変化させたり、翻訳効率を上げたり、半減期を伸ばすことが可能になります。当社では、使用例の多いN1-メチルシュードウリジン(N1-Methylpseudouridine :m1Ψ)を提供しています。 N1-Methylpseudouridine (m1Ψ) はtRNAで初めて同定された自然由来のヌクレオチドで、mRNAにおける有効利用は最近になって知られるようになりました。このメチル化ウリジンをウリジンの代わりにmRNA IVTで取り込ませ、ワトソンークリックの塩基対を変更することなく翻訳ななされます。この修飾ヌクレオチドを利用する一番のメリットはmRNA治療においてRNAレセプターによる認識を防ぎ、不必要な免疫反応を抑制し、転写物の安定性と翻訳を増強できることです。