EGFPまたはHiExpress™ルシフェラーゼ IVT mRNA

VectorBuilderでは既製品として、in vitro そして in vivo実験にすぐに使用可能な EGFPおよびルシフェラーゼmRNAをご提供しています。弊社のmRNAの品質と効果は培養細胞と動物モデルにて発現が高く認められることが検証済であり、mRNA デリバリー効率の確認や他のmRNA実験のコントロールとして使用することができます。カスタムmRNA 生産やデリバリーについては、ベクタービルダーの mRNA遺伝子デリバリーソリューションズ にて詳細をご覧ください。

特徴
  • mRNAは Cap 1, 検証済み5’と3’ UTRs, と110nt polyAテールを含むように製造し、N1-Methylpseudouridine (m1Ψ) などを修飾したヌクレオチドを取り込むことも可能です
  • コドン最適化された HiExpressTM Firefly Luciferase mRNAは容易に強力な発現を実現します。
  • シークエンスの検証、完成度、キャッピングの効率、純度、そして発現の検証など、総合的な品質保証を行っています。

ご注文方法

価格と作業日数

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発送と保存

mRNA製品は1mMクエン酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.4) に保存されています。mRNA製品はドライアイスで凍結出荷され、-80°Cで12ヶ月まで安定して保存できます。品質の低下を予防するために、凍結融解の繰り返しは避けてください。

技術情報

mRNA製造過程と品質検査のワークフロー 

図 1. in vitro 転写からの一般的なmRNA合成のワークフロー

当社のmRNA製造のワークフローは、まずデザインとテンプレートDNAの合成から始まります。ベクターデザインでは、最適コドンの選択、GC含量の調整、RNA2次構造の熱力学的安定性などを考慮してデザインされ、in vitro転写ベクターにクローニングします。次にプラスミドDNAは精製され、検証され、リニア化されます。リニア化されたDNAからin vitro 転写反応を行い、目的のmRNAを製造します。in vivo翻訳を向上させ、免疫原性を低下させる目的で、in vitro転写反応に修飾ヌクレオチドを取り込ませることも可能です。高効率なキャップ付加(>95%) は、共転写または酵素反応によって行います。転写されたmRNAはmRNA-結合ビーズを使って精製し、さらに品質検査を実施し、検査に合格したmRNAを納品します。

実験による検証

図 2. HeLa細胞をつかったEGFP IVT mRNA発現。 EGFP mRNAは修飾核酸N1-Methylpseudouridine (m1Ψ)の有り、無しの状態で合成した。12-well plateで培養したHeLa細胞に1ウェル当たり1 ugのmRNAをトランスフェクションした。(A) トランスフェクション後、24時間、48時間そして72時間後のEGFP発現量をフローサイトメトリー法で解析した結果を示す。平均蛍光強度(Mean fluorescence intensities:MFI)は棒グラフにて、EGFP陽性細胞の割合は丸、四角、三角で示した。エラーバーは標準偏差(standard deviation:SD)を示す(B)EGFP mRNAをトランスフェクションしてから48時間後のHeLa細胞のGFP蛍光画像を示す。

図 3. HiExpressTM Firefly Luciferase IVT mRNA発現の in vitro と in vivoでの検証。(A) HiExpressTM Firefly Luciferase mRNAと他のluciferase mRNAの発現をHEK293T細胞で比較、検討した。12-well plateで培養したHeLa細胞に1ウェル当たり 0.5 ug のmRNAをトランスフェクションし、luciferase活性を6時間後、24時間後、48時間後、そして72時間後に測定した。 (B) C57BL/6マウス成体に30ugのLNPカプセル化mRNAを筋注し、6時間後、24時間後、48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。Fluc WTは野生型のホタルルシフェラーゼ、Fluc WT (co) はコドン最適化した野生型ホタルルシフェラーゼ、Fluc2 はluc2 ホタルルシフェラーゼを示す。

関連技術情報
化学物質等安全データシート  (MSDS)
品質検査証明書 (Certificate of Analysis, COA)
ユーザーインストラクション カタログとフライヤー

Q&A

mRNA capと capping methodの違いは何でしょうか?

Cap 0 は 真核生物mRNAsの 5’ 末端に 5’ から 5’ 三リン酸結合によってN7-methylguanosine (m7G) が付加されます。この修飾はいくつもの酵素反応を介して転写と共に行われ、核輸送や転写物の安定性、真核生物翻訳開始因子(eukaryotic translation initiation factor:eIF4E)による認識を促進します。Cap 1はm7G capに加えて、転写されたmRNAの最初のヌクレオチドの2’Oにメチル基を付加することを示します。哺乳類細胞ではcap1構造はmRNAが自身のものであると認識する上で重要であり、自然免疫系に標的とされないために必要です。Cap 1構造を合成mRNAに付加することにより、in vivoにおけるmRNAの発現増強と免疫原性を抑制できることが示されています。in vitro転写RNAへのキャッピングは転写をキャップアナログを使用して行うか、転写後に酵素反応によって行うことが可能です。弊社のキャッピング方法はLC-MSを用いた検証で効率も検証されています。

なぜ修飾ヌクレオチドの取り込みを検討するのでしょうか?またどの修飾を使うとよいでしょうか?

細胞は細胞質とエンドソームにRNAレセプターを持っているため、外来のRNAがレセプターによって認識されると免疫反応が活性化します。修飾ヌクレオチドは内因性RNAに共通して検出される構造です。そこで、特定の修飾ヌクレオチドを合成mRNAに取り込ませることにより、免疫原性を抑制することができます。またシークエンスを工夫するkとおで、mRNAの2次構造を変化させたり、翻訳効率を上げたり、半減期を伸ばすことが可能になります。当社では、使用例の多いN1-メチルシュードウリジン(N1-Methylpseudouridine :m1Ψ)を提供しています。 N1-Methylpseudouridine (m1Ψ) はtRNAで初めて同定された自然由来のヌクレオチドで、mRNAにおける有効利用は最近になって知られるようになりました。このメチル化ウリジンをウリジンの代わりにmRNA IVTで取り込ませ、ワトソンークリックの塩基対を変更することなく翻訳ななされます。この修飾ヌクレオチドを利用する一番のメリットはmRNA治療においてRNAレセプターによる認識を防ぎ、不必要な免疫反応を抑制し、転写物の安定性と翻訳を増強できることです。