プール型CRISPR/shRNA ライブラリー作製

VectorBuilderではラージスケールの機能スクリーニングを行うための、カスタムCRISPRやshRNAライブラリーの受託作製サービスを提供します。VectorBuilderでは既に最適化を行ったベクターを使い、高いクオリティーのプール型ライブラリー作製に豊富な経験があります。ライブラリーの納品形態は、E. coli グリセロールストック(カルタヘナ法に基づく情報提供書類をお付けします)、DNA、またはパッケージ済ウイルス(カルタヘナ法に基づく情報提供書類をお付けします)など、顧客のニーズに幅広く対応します。カスタムライブラリーは次世代シークエンス法によって、完全に検証されているため、ユーザーはスクリーニングによって、どの遺伝子を分離したか効果的に結果を得ることができます。

プール型CRISPR/shRNAライブラリー作製サービスの見積もり方法

ホームページの デザインリクエストを送る ボタンをクリックし、必要なライブラリーの情報をサブミットしてください。VectorBuilderの研究者が、価格、納期、必要情報を含んだサービスプロポーサルを作成し、リンクをメールにてご連絡いたします。プロポーサルに満足されたら、サービスプロポーサルをショッピングカートに入れて、インストラクションに沿ってご注文ください。

プール型CRISPR/shRNA ライブラリーの種類と遺伝学的スクリーニングへの使用目的
プール型CRISPRライブラリー

プール型 CRISPR ライブラリーは、大規模またはゲノム単位での、遺伝子コーディング領域やノンコーディング領域の機能性スクリーニングに効果的なライブラリーです。このライブラリーを使って目的のパスウェイ、疾病、薬剤処理に対する細胞のレスポンス、発生過程、遺伝子調節などに関わる機能をもつ領域のスクリーニングが行えます。 次の表にCRISPRを使った場合のスクリーニングの種類をリストし比較しています。

スクリーニングの種類  メカニズム ターゲットとされる機能領域  アプリケーション
ノックアウト Cas9 または Cas9 ニッケースはターゲットサイトのDNAの切断に用いられます。DNAの切断部位の修復が行われる際、ランダム突然変異(欠失、挿入など)がターゲットサイトに導入されます。 主にコーデイング領域 主にコーデイング遺伝子の機能性スクリーニング
CRISPRa (転写活性型) 転写活性ドメイン(例えば VP64)を融合した酵素不活性型 Cas9 (dCas9) はターゲットサイトによって調節された遺伝子転写を活性化するのに用いることができる。 主にプロモーター領域と他のノンコーデイングな調節領域 コーデイング遺伝子の機能獲得型又はノンコーデイング領域の調節機能のスクリーニング
CRISPRi (転写抑制型) 転写抑制ドメイン(例えば KRAB)を融合した酵素不活性型 Cas9 (dCas9) はターゲットサイトによって調節された遺伝子転写を抑制できる 主にプロモーター領域と他のノンコーデイングな調節領域 コーデイング遺伝子の機能欠損型又はノンコーデイング領域の調節機能のスクリーニング

主にノックアウトスクリーニングのため、プール型CRISPRライブラリーは1または2ベクターシステムのフォーマットで作成出来ます。1ベクターシステムでは、Cas9 または変異型 Cas9 はgRNAと同じベクターから発現されます。一方2ベクターシステムでは, Cas9 または変異型Cas9 はgRNAを発現するベクターとは別のベクターから発現されます。選択的に, 2ベクターシステムではgRNA発現ベクターをCas9 を安定に発現する細胞株に導入出来ます。1ベクターシステムの利点は2つの異なったベクターを細胞に共トランスフェクションそしてトランスダクションを避けることと、そして安定にCas9発現細胞での利用可能性に制限がありません。  しかしながら1ベクターシステムは2ベクターシステムと比較して用途が制限され、クローニングとウイルスパッケージングで効率の低い可能性があります。

shRNAライブラリー(プール型)

プール型shRNAライブラリーは哺乳類細胞で大規模又はゲノムワイドの機能欠損スクリーニングを行うための強力でコストパフォーマンスのよいツールとして役に立っています。CRISPRベースドノックアウトスクリーニングの主な欠点は、CRISPRによる突然変異の確率的性質のため、ノックアウトの効果で細胞間のばらつきが大きいことです。対照的にshRNAライブラリー(プール型)は一般的に、標的遺伝子について一定のノックダウンの効果生じます。カスタムshRNAライブラリー(プール型)構築に加えて、VectorBuilderでは高品質なヒトそしてマウスをターゲットにした既存のpooled shRNAを提供しています。ヒトとマウスに関しては, VectorBuilderは以下の2つのスケールでready-to-use レンチウイルスライブラリーを提供しています: 全ゲノム(~19,000 RefSeq genes) と精鋭遺伝子Elite Gene (~2,000最も頻繁にPubMed Centralで引用された遺伝子)。 各々の遺伝子は5-6 の異なったshRNAによってターゲットにされています。それらのライブラリーは次世代シークエンシングと機能アッセイによって充分に検証されています。

プール型shRNA ライブラリー(既成品)についてもっと情報を読む >>

提供するサービス一覧
提供するサービス サービス内容のご説明 参考価格(税抜き) 参考納期
カスタムライブラリー作製ストラテジーのデザイン 無料 1-4 日*
カスタムCRISPR または shRNA ライブラリー(プール型)作製 gRNA/shRNAのアレイベースのオリゴ合成, gRNA/shRNAのベクターへのクローニング及び次世代シークエンシング(NGS)**によるプラスミドプールの検証を含みます。 ¥628,000より 6-8 週間
既存のプラスミドライブラリープールの増幅*** 既存のプラスミドライブラリーをプラスミドプールとしてお持ちの場合(例えばアドジーンから入手したCRISPR プラスミドプール), VectorBuilderではウイルスにパッケージングいたします。 増幅のステップはウイルスパッケージングの為に十分なDNAを得ることが必要があります。このために、プラスミドプールは平均100x存在量(representation)以上で大腸菌にトランスフォームし、そしてプラスミドDNAはウイルスパッケージングのために調製します。  ¥40,500より 10-16 日
プールしたライブラリーのウイルスパッケージング ウイルスパッケージングサービスに関しては、こちらをご覧ください here 
既存のプラスミドライブラリープールのNGSによる検証 VectorBuilderは増幅の前およびまたは後にNGSによって既存のプラスミドライブラリープールの品質を検証することができます。このサービスは、プラスミドプールからNGS ライブラリーの調製、イルミナシークエンシング(500回以上のカバレージ)そしてデーター解析が含まれます。 プラスミドプール当たり ¥62,500 より 3-5 週間
スクリーニングによって得られたサンプルのNGSデコンボリューション  スクリーニングされた細胞のゲノムDNAからのNGSライブラリーの調製、イルミナシークエンシング(500回以上のカバレージ)およびデーター解析が含まれます。 サンプル当たり¥62,500 より 3-5 週間
その他、カスタムライブラリー作製  お問い合わせください

* gRNA や shRNA のデザインが必要な場合、プロジェクトによって納期が変わります。
** デフォルト納品形態は大腸菌のグリセロールストックです。
*** ユーザー提供の既存プラスミドライブラリープールからの作製の場合、既存プラスミドライブラリーの状態や均一性が反映され、最終納品産物のクオリティーを100%保障することが不可能なことを御了承ください。

サービスの詳細
カスタムライブラリー構築のストラテジーをデザイン

もしgRNA又はshRNAのシークエンスをお持ちでない場合、VectorBuilderは最適化されたパイプラインと強力なコンピュターのリソースを使用して、ユーザーのターゲット遺伝子またはゲノム領域のgRNA又はshRNA プールのデザインを無料で行います。ユーザーの研究ニーズに応じて、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、piggyBac及びプラスミドなどのライブラリー構築には、ベクタービルダーで通常使用しているベクターバックボーンからの選択や、ユーザー提供のベクターバックボーンからのライブラリー構築を選択できます。2ベクターCRISPRライブラリーでは、ユーザーのスクリーニングストラテジーに適したCas9 又は変異型 Cas9 の発現ベクターをデザインし、ベクターとライブラリー構築も可能です。

カスタムCRISPR/shRNAライブラリー作製(プール型)

VectorBuilderは高品質で低エラー率のgRNA又はshRNAのオリゴプールを合成するために、チップベースのでオリゴを合成しています。オリゴは最低限のサイクルでPCR増幅し、ターゲットに対して平均100倍以上の representationを保持して、ベクターバックボーンにクローニングされています。構築されたCRISPR又はshRNA ベクターライブラリーは大腸菌に形質転換され、指数増殖期にグリセロールストックを作成しています。ライブラリーの品質の信頼度を評価には、NGSを行い、 gRNAまたはshRNA のプラスミドプールについて500倍以上のシークエンスカバーレージを保証することを確認しています。 NGSデータの解析からは、プール内での標準化された分布をもつ すべてのgRNAまたはshRNAが検出されることを確認します。

既製プラスミドプールの増幅

VectorBuilder は他のリソース(例えばAddgeneなど)からの既存のプラスミドライブラリーの増幅なども受託作成いたします。VectorBuilder は最初にプール型プラスミドを平均100倍以上の存在量(representation)になるよう、スーパーコンピテントセルに形質転換します。大腸菌は指数増殖期でグリセロールストックを作製し納品が可能です。

さらに大腸菌グリセロールストックから、関連サービスとして、ウイルスパッケージングもご提供しています。プラスミドDNAをエンドトキシンフリーのマキシプレップで精製し、ご依頼のウイルス粒子にパッケージングを行い、ウイルスを納品します。

VectorBuilder は実際の平均gRNA/shRNA fold representation を算出するためトランスフォーメイションののちコロニー数をカウントします。VectorBuilderは形質転換前と形質転換後にプラスミドプールのNGS検証を行い、fold representationを求めます。
VectorBuilder はコロニーをカウントすることで推定される100倍以上の平均representationを保証します。しかし、ユーザー提供の既存プラスミドライブラリープールからの作製の場合、既存プラスミドライブラリーの複雑性や均一性のばらつきにより、最終納品産物のrepresentationの100%保障が適用できないことをご了承ください。

プールされたライブラリーのウイルスパッケージング

CRISPR/shRNA スクリーニングでは、レンチウイルス またはアデノ随伴ウイルスなどのウイルスを介してプール型ライブラリーを細胞に導入する必要があるかもしれません。VectorBuilderはタイター、純度、生存率及び一貫性に関してウイルスパッケージングプロトコールを大幅に改善した独自の技術と試薬を開発しました。 当社のパッケージングプロトコールはクローニングサービスで使用されるウイルスべクターシステムにも最適化されています。VectorBuilderのクローニングやウイルスパッケージングサービスを一度ご利用いただいたユーザーの多くが、リピーターとなり、ユーザーの満足度が高いことが特徴です。
ウイルスパッケージングサービスについてもっと情報を読む>>

スクリーニング後に得られたサンプルのNGSデコンボリューション 

スクリーニング後に、どのような方法でNGSによってヒットを特定するか? そのような場合は、ポストスクリーニングゲノムDNAをVectorBuilder に送ってください。VectorBuilder は数週間でNGSライブラリー作成, ハイスループロットシークエンシングを行い、データ分析そしてgRNAまたはshRNAの正確なカウントデータをお届けします。NGSの完了は、メールでユーザーにご連絡します。未処理の NGSシークエンスデータと解析したデータは、リンク先のFTPサイトより、ユーザーのローカルサーバーにダウンロードしていただけます。VectorBuilderは、解析終了後、3ヶ月間、ユーザーデータをFTPサイトに無料で保存します。ご依頼によっては、データの3か月以上の長期保存も行います。

その他のカスタムライブラリー作製(ファージディスプレイ、two-hybridなど)

CRISPR/shRNA以外の大規模スクリーニングを行うカスタムベクターライブラリーが必要な場合、VectorBuilderにお問い合わせください。ファージディスプレイ、イーストtwo-hybrid、遺伝子発現ライブラリーなど、様々なご要望にお応えします。VectorBuilderのホームページの  デザインリクエストを送る にライブラリーの種類、スクリーニングのアイデアを書いてお問い合わせください。VectorBuilderの研究員が、2~3 日でサービスプロポーサルをご提出いたします。