プール型shRNA ライブラリー

VectorBuilderはヒトとマウス遺伝子に対して、高品質のプール型shRNAライブラリーを提供しています。ライブラリーは Ready-to-use(すぐに使用可能な)のレンチウイルスパッケージされた仕様で納品され、全遺伝子(~19,000 RefSeq遺伝子)とエリート遺伝子(PubMed Centralの論文でよく引用されている~2,000種の遺伝子)の2種類のライブラリーがあります。shRNAは、可能な限り個々の遺伝子に対して5-6種類の異なるshRNAによってターゲットされるようにデザインされています。このライブラリーで哺乳類細胞のゲノムワイドのloff-of-functionスクリーニングにパワフルにまたコストパフォーマンスよく対応できます。
プール型shRNAライブラリーを使った従来の遺伝学的スクリーニングワークフローを図1に示す。まず、対象細胞にshRNAレンチウイルスライブラリーを導入し、陽性の細胞をレンチウイルスゲノムに組み込まれていたマーカー(例えば、薬剤耐性や蛍光マーカー)で選択する。 次に、陽性細胞を参考集団と実験集団の2つに分け、実験集団にのみ特定の選択圧(たとえば、薬剤処理や継代のくりかえし)を与えて、研究対象の表現型を示す細胞を分離する。ここに大きく分類して3種類のスクリーニング法がある:1) Viability 選択; 選択圧に晒された後、生存した細胞でshRNAのエンリッチメント(濃縮)またはデプリ―ション(枯渇)を検出する; 2) レポーターによる選択; shRNAがエンリッチされた細胞でレポーター遺伝子の発現レベルが上昇、または低下することを指標としたスクリーニング(例えば、shRNAが転写因子をターゲットし、マーカー発現を変化させる場合など); 3) behavior 選択;shRNAが細胞の浸潤、マイグレーションなどの運動性に関与している場合の選択。 スクリーニングの後、実験集団と参考集団の両方をハーベストし、実験集団でエンリッチまたはデプリートされたshRNAをサンガーシークエンスまたはNGSで参考集団と比較分離する。shRNAによって、エンリッチまたはデプリートされた候補遺伝子群は、さらに種々の機能解析実験によって特定される。
図 1. プール型 shRNA レンチウイルスライブラリーを使い、loss-of-functionスクリーニングを行う場合のワークフロー。Acta Biochim Biophys Sin 44:103-112 (2012)から引用。
製品内容の詳細
ゲノムワイドターゲッティングと高度の複雑性:ヒトそしてマウスの両種に対し、ホールゲノム(~19,000 RefSeq genes) そして エリート遺伝子 (~2,000 種のPubMed Centralに引用された遺伝子群)の2種類のshRNAライブラリーを提供します。通常VectorBuilderのshRNAライブラリーは個々の遺伝子に対して5-6種の異なったターゲットシークエンスに対する shRNAs を含んでいます。ターゲットシークエンスの ノックダウンスコアー は、TRCのRNAi consortiumのガイドラインに基づいて値を求め、高いノックダウンスコアーを出したシークエンスを選んでいます。その結果、信ぴょう性の高いノックダウンに基づいた効率的なスクリーニングが行えます。
高い均一性: プール型プラスミドライブラリーは次世代シークエンス法(NGS)で検証されています。エリート遺伝子ライブラリーでは、100%のshRNAsを、またホールゲノムライブラリーでは >97%のshRNAsをカバーしています。さらに、プラスミドライブラリー中のshRNAの再現性は高い均一性を保持しています (図2参照)。
図 2. 異なるプール型プラスミドライブラリーのshRNAの分布。shRNAの読み取り数はNGSライブラリーサイズ(10億リード)で平均化され、log2スケールプロットしている。
機能を余すことなく設計されたレンチウイルスベクターと高タイターのレンチウイルスがready-to-useで提供される: プール型shRNAライブラリーは第3世代のレンチウイルスベクターシステムを使っています。プロモーターはヒトU6プロモーターを採用しているため、様々な細胞で、安定に遺伝子ノックダウンを行える高効率のシステムです。このレンチウイルスベクターシステムは、shRNAを細胞に永久的に、効率よく、均一に導入できるため、in vitro遺伝子スクリーニングに最も適しています。全てのプール型shRNAライブラリーは、有効タイターが>108 TU/ml のready-to-useレンチウイルスとして提供されます。そのためウイルスパッケージングやタイター測定などの手間を大幅に省き、実験をただちに開始することができます。第3世代のレンチウイルスベクターシステムは、自己複製能を無効化しているため、バイオセイフティレベルが向上しています。
図 3. レンチウイルスshRNAノックダウンベクターのマップ
導入された細胞を、効率的に多目的に選択または追跡できるデュアルマーカー: EGFPとピューロマイシンを発現するデュアルマーカーカセットを持つレンチウイルスベクターは、導入された細胞をピューロマイシンで選別し、緑色蛍光で可視的に細胞を追跡。
図 4. EGFP を発現している293T 細胞はヒトエリート遺伝子プール型shRNAライブラリー(MOI=10)を導入してる。図4はピューロマイシン(1.5 ug/ml)で選別をした4日後の細胞。倍率: 200x。左: 明視野イメージ。右:蛍光顕微鏡イメージでGFPを発現している細胞。
プール型shRNA スクリーニング: プール型 RNAi スクリーニングは、アレイ型RNAi スクリーニングに比べて、数々の利点がある。比較を以下の表に示す:
アレイ型スクリーニング プール型スクリーニング
目的細胞へのshRNAsの導入方法 マルチウエルプレート(例 96-well、384-wellなど)で増殖している細胞に対してshRNAsを導入する。 細胞集団に対して、数百種や数千種のshRNAs を一度に導入する。
shRNAsに起因した目的の表現型の検出方法は? 対象としている表現型を示しているウエルを1つ1つ確認することで選択。それぞれのウエルに導入されているshRNAはこの段階で同定可能。 対象としている表現型を示している細胞は細胞集団として選択。エンリッチ/デプリートされた shRNAs はシークエンスで同定。
遺伝学的相互作用を検出できるか?

不可能(1種類のshRNAが1ウエルに加えられた場合 )または

限定的(1種類以上の shRNAs がウエルに加えられた場合).

可能 (細胞は複数のランダムコンビネーションのshRNAを導入されている)
操作テクニックに起因するデータのバリエーション
労力と試薬のコスト
専用機器の必要性 高 (例えば、リキッドハンドラー、ハイスループットイメージングなど) 低 (従来のラボベンチ設置の機器)
注文情報
製品名称 遺伝子数 shRNAs数 スケール * カタログ番号 参考価格(税抜き)
ヒト エリート遺伝子 プール型 shRNAライブラリー 2,161 12,471

中容量

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

Lib-LV-shRNA-hE-M ¥639,000
マウス エリート遺伝子プール型shRNAライブラリー 2,233 12,472

中容量

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

Lib-LV-shRNA-mE-M ¥639,000
ヒト ホールゲノム プール型shRNAライブラリー 18,432 92,917

中容量

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

Lib-LV-shRNA-hW-M ¥639,000

プラス

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

Lib-LV-shRNA-hW-P ¥1,889,000
マウス ホールゲノムプール型shRNAライブラリー 19,790 92,917

中容量

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

Lib-LV-shRNA-mW-M ¥639,000

プラス

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

Lib-LV-shRNA-mW-P ¥1,889,000
* エリート遺伝子ライブラリーは、中容量で >40 のスクリーニングを 100x shRNA カバーで行える。ホールゲノムライブラリーは、中容量で >5 のスクリーニングを100x shRNA カバーで行える。プラススケールライブラリーでは、>25 スクリーニングを 100x shRNA カバーで行える。
デコンボリューションサービス
スクリーニングした細胞のshRNAヒットを同定するには、細胞からゲノミックDNAを抽出してVectorBuilderに送付してください。VectorBuilderはNGSライブラリーを調整し、ハイスループットシークエンシングを行い、データーを分析します。サンプル当たりのshRNAカウントを1-2週間でお届けします。
デコンボリューションサービスのご依頼は、VectorBuilderホームページの デザインリクエストを送る から。